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禽白血病病毒的亚群和准种多样性及其在不同选择压作用下的演变
  

禽白血病又称之为禽白血病/肉瘤,是指由一类禽反转录病毒引起的鸡的良性及恶性肿瘤性疾病。这类病毒通称为禽白血病/ 肉瘤病毒(avianleukosis/sarcoma viruses, ALSV),但通常简称为禽白血病病毒(avian leukosis viruses, ALV)。ALV 中的罗斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus, RSV) 是第一个被证明可诱发肿瘤的病毒。Peyton Rous 在1911 年首先报道了将自然发生的鸡肉瘤滤过液再接种鸡后可诱发同样的肿瘤,这是第一次用实验直接证明病毒可以引起肿瘤,这一发现使他们在1966 年获得了诺贝尔生理学或医学奖。此后,又以ALV 为主要研究对象发现了反转录酶和cDNA 及原癌基因,也分别在1975 和1989 年获得诺贝尔生理学或医学奖。ALV 是属于反转录病毒科(Retroviridae) 正反转录病毒亚科(Orthoretrovirinae) α 反转录病毒属(Alpharetrovirus) 的一类病毒。该科病毒的基因组是RNA,以具有反转录酶为特征。

ALV 基因组大小约7.8 kb,其基本结构是由gag、pol 和env 3 个编码基因及两端的非编码序列5'UTR 和3' UTR 组成的。gag 基因编码的是衣壳蛋白,pol 基因产物是功能蛋白,两者都比较稳定;env 基因编码的囊膜糖蛋白与宿主易感性病毒中和反应密切相关,是ALV 亚群分类的基础,也是最容易发生变异的基因。env 基因产物多分为二部分gp85 和gp37,位于病毒粒子表面的gp85 蛋白更容易发生变异。ALV 的5' UTR 和3' UTR 及由其组成的LTR是另一个容易发生变异的区域,虽然不编码任何蛋白质,但它与ALV 的前病毒cDNA 的合成及整合进宿主细胞基因组过程密切相关。

早在20 世纪70 年代时,未经净化的鸡群普遍都感染了ALV。在商业化经营的鸡群中由ALV 感染造成的死亡率为1%~2%,只是偶尔可达到20%,甚至更高。在通过对原种群严格的病毒净化措施后,到1987 年基本控制和清除了经典的禽白血病。但是在1988 年,又从英国的白羽肉鸡中出现了新的 J亚群ALV,并很快传播至全世界几乎所有的白羽肉鸡群,给养鸡业造成了极大的经济损失,我国也受到严重波及。虽然经过严格的种群净化,我国的白羽肉鸡和蛋用型鸡中也基本控制和清除了禽白血病,但ALV-J 已传入我国各地大量饲养的黄羽肉鸡及各种原始地方品种鸡,有的发病还很严重,相应的净化措施还有待持续进行下去[5]。在PubMed 收录的2010—2015 年期间发病的有关ALV 的168 篇论文中,有112 篇来自中国,占了2/3,反映了这期间鸡白血病的严重性及我国学者关注的程度。

1、ALV亚群多样性及新亚群的出现和发现

病毒识别宿主细胞的特异性及病毒中和反应主要与囊膜蛋白gp85 相关。根据gp85 的特性,迄今为止将ALV 分为A、B、C、D、E、F、G、H、I和J 等10 个亚群。不同的鸟类可能感染不同亚群的ALV,但自然感染鸡群的还只有A、B、C、D、E 和 J 6 个亚群[2,4]。鸡的这6 个亚群的gp85 的同源性关系见表1。

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1.1 经典的外源性A、B、C、D和内源性E亚群ALV

1988 年前,A/B 亚群是鸡群白血病的最常见病原,主要引起淋巴肉瘤白血病,也会引起其他细胞类型肿瘤,如纤维肉瘤、骨髓细胞瘤、成红细胞瘤、肾瘤、骨硬化等。也发现C/D 亚群,但比较少见。内源性E 亚群是稳定地整合进鸡基因组的ALV,可通过染色体遗传,并释放游离病毒,但没有致病性或致病性很弱。

1.2 J亚群的出现、流行及其危害

1988 年,英国学者从白羽肉鸡中分离和鉴定出在抗原性、细胞嗜性、致病性和gp85 序列上与经典的A~E 亚群显著不同的新的J 亚群ALV (ALV-J),其原型毒为HPRS-103 株。J 亚群与其他亚群间gp85 序列只有30%~40% 的同源性( 表1),显著不同于经典的A~E 亚群。J 亚群致病性和传染性比原有的经典亚群强得多,它在白羽肉鸡主要引起骨髓细胞瘤,平均发病死亡率3%~10% 。ALV-J随进口的白羽肉种鸡传入我国后,初期仅在白羽肉鸡中流行,但随后又传入我国地方品种鸡 和蛋用型鸡。在2008—2009 年期间,给我国蛋鸡业带来了极大损失。ALV-J 在蛋鸡虽然也是以诱发骨髓细胞瘤为主,但也有很高比例的病鸡呈现皮肤血管瘤的临床表现。ALV-J 传入我国地方品种鸡群后,其传染性和致病性逐渐增强,已成为我国地方品系鸡群中禽白血病的主要致病亚群。ALV-J 的另一个特点是其gp85 变异范围很大,详见下章节“2”。

1.3 中国地方鸡群中新鉴定出的K亚群

2010 年以来,在用DF1 细胞培养对我国一些地方鸡群做ALV 感染状态检测时,也分离到一些ALV 野毒株。它们相互间gp85 蛋白序列同源性显著高于与其他亚群的同源性程度,很难把它们划归哪一类鸡群中已知的亚群。根据发现先后的定名习惯,可划为一个新的亚群K ( 表1),以2011 年从临床健康的芦花鸡中分离到的JS11C1 株为代表株。随后,又陆续从不同省份的地方品种鸡群中分离到类似的26 株病毒,它们gp85 间的同源性达91.9%~100%。到目前为止,还没有从引进的白羽肉鸡或蛋用型鸡中分离到。从表1 可见,ALV-K 的gp85 氨基酸序列与A~E 亚群同源性在77.1%~86.0% 的范围内,与J 亚群仅为35.3%~37.8%,但列为K 亚群。此外,与野鸟中有序列发表的F 亚群的同源性也只有57.1%。根据现有发表毒株的比较资料,同一亚群ALV 的 gp85 同源性都应在90%以上,或非常接近90% ( 表1)。显然,K 亚群明显不同于鸡源ALV 的其他6 个已知亚群。JS11C1 株与GenBank 中来自台湾土著鸡分离株TW-3593(HM582658) 的gp85 氨基酸序列同源性达92.5%,与日本报道的也是从土著鸡分离到的6 株病毒的gp85 的同源性也在90% 以上。而当时这几株病毒仍被归为A 亚群,虽然与A 亚群gp85 的同源性均低于90%。

ALV-K 的绝大多数毒株都是从临床健康鸡分离到的,显然其致病性并不强,这也是为什么长期以来没有发现这个亚群,只是我们近几年在对地方品种鸡做普遍的流行病学调查时才发现。人工接种1日龄SPF 鸡,可以诱发感染和病毒血症并从泄殖腔棉拭子检出病毒,但在5、10、15 周龄时剖解感染鸡,并未发现任何肉眼病变和病理组织学病变,只是在6 个月后才有一只发生肿瘤。


2、ALV-J流行株gp85的多样性及其变异趋势

ALV 基因组上gp85 是最容易发生变异的基因,它也是决定ALV 亚群的基础。在鸡的A~E 和K 这6 个亚群间的同源性都在75% 以上,但J 亚群与其他亚群的同源性都很低,只有30%~40%。然而,在J 亚群内的不同毒株间变异却很大,同源性最低的只有大约80%。

2.1 2003年前国内外白羽肉鸡中ALV-J流行毒株gp85演变趋势

在20 世纪90 年代,除了英国外,ALV-J 主要是从美国的肉鸡群中分离到的。根据1997 年前对在美国分离到的20 多株ALV-J 的gp85 序列的同源性比较,推论ALV-J 的gp85 会越来越偏离ALV-J的原始毒HPRS-103。但是,对1999—2003 年期间从我国白羽肉鸡分离到的ALV-J 的进一步分析却发现,中国后来分离的毒株并没有进一步偏离原始毒,而是似乎以一个同心圆或同心球的方式在有限范围内从圆心或球心向各个方向随机变异,即中国在2000 年后分离到的毒株与HPRS-103 的同源性并不低于美国在1997 年前的分离株( 表2),虽然中国的白羽肉鸡的种鸡大部分还是来自美国。

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2.2 2005年后不同遗传背景鸡群AVL-J分离株gp85同源性多样性及变异趋势

为了比较ALV-J 在不同遗传背景鸡群中分离物的gp85 的变异趋势,本文对过去25 年不同来源的147 个分离株做了比较分析。其中来自白羽肉鸡的28 个国内外毒株的序列均已登陆GenBank,且已有相论文发表。我国黄羽肉鸡和蛋鸡中的ALV-J 都是本实验室最早分别在2005 年和2006 年分离到。从蛋鸡分离到的51 个ALV-J 毒株大多是2008—2010年期间由扬州大学、中国农业大学、华南农业大学和农业部动物疫病控制中心分离到,且已登陆GenBank,部分已发表相关论文。还有部分是本实验室在2011 年后的继续跟踪研究中分离到的。从黄羽肉鸡42 个ALV-J 毒株和从地方品种鸡中分离到的26 个毒株则大多数是2010—2013 年期间在本实验室分离到,其中部分毒株序列已登陆GenBank。还有少数是广西大学和华南农业大学分离到,均登陆GenBank。为了节省篇幅,所有GenBank 的登陆号均不予一一列出。

2.2.1 ALV-J的gp85序列同源性程度与不同遗传背景鸡群适应性的关系

对上述不同类型鸡群分离株的gp85 的同源性程度的比较结果见表2。可以看出,不同遗传背景来源ALV-J 相互间 gp85 同源性范围并无明显差别,即不同类型鸡群来源的毒株间同源性变异范围与各个同一类型鸡内部的同源性变异范围几乎相同。也就是说,对不同类型鸡群ALV-J 不同毒株gp85 序列的同源性比较,不能找出ALV-J 的gp85变异与不同毒株对不同遗传背景鸡群的适应性变化的关系。

2.2.2 不同遗传背景鸡群来源ALV-J的gp85序列系谱发生分析

比较上述已收集到的来自不同类型鸡群的ALV-J 的gp85 序列,用同源性比较却看不出同源性程度与毒株对不同类型鸡易感染性间的关系。但是,当对这些毒株序列做遗传系谱发生比较时,似乎大多数毒株gp85 在遗传系谱发生树中的分布还是与毒株来源鸡的类型有一定关系的。由图1 可见,除了少数毒株,来自同一类型鸡的毒株往往都集中分布在一个区域,虽然它们间的同源性程度有很大差别。这似乎表明,在对ALV-J 的gp85 序列做比较分析时,遗传系谱分析比数字化的同源性程度比较更能代表毒株间的遗传演变与对不同遗传背景宿主适应性的关系。这也表明,对gp85 序列的同源性程度比较与系谱发生树间的依据是不同的。这方面的研究还有待进一步深入下去。 

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2.3 ALV-J分离株gp85随分离年份的变异趋势分析比较

对上述章节2.2 中从不同地区不同遗传背景鸡群分离的146 个ALV-J 毒株的 gp85 序列分别与1988 年分离的原型毒株 HPRS-103 的同源性分别做了比较,发现1990、2000、2001、2002、2003、2005、2006、2007、2008、2009、2010、2012和2013年的分离株与HPRS-103 的同源性分别为86.6%~95.5%、89.9%~92.5%、90.3%~92.2%、89.9%~92.2%、90.6%~95.8%、89.9%~91.9%、89.2%~91.2%、88.3%~92.9%、89.9%~96.7%、87.9%~96.4%、87.9%~93.8%、87.0%~92.5% 和86.8%~92.1%。这一结果表明,ALV-J 流行毒株的gp85 并没有随年份越来越偏离原型株HPRS-103。如果选择最新分离到的与HPRS-103 同源性最低和最高的两毒株LH5-15 (86.8%) 和JS13-LY1-5 (92.1%) 分别同其他不同时间分离到的毒株做gp85 同源性比较,结果完全类似。将这3 种比较的数字分别用回归方程做统计学分析表明,毒株的分离时间与它们的gp85相互间同源性程度相关性很低,即流行株与原始毒株 HPRS-103 的偏离度与分离年份的远近无关。从上述数据可以看出,随年份的增加,ALV-J 流行毒株的gp85 并没有越来越偏离原型株HPRS-103,即流行株与HPRS-103 的偏离度与分离年份的远近无显著相关性。但后分离株相互间的差异程度可能超过与原型毒间的差异程度。这再次证明了本实验室在2003 年对早期白羽肉鸡分离株的分析结果的推论,即ALV-J 的gp85 是以HPRS-103 为同心圆( 球) 圆( 球) 心在一定范围内向不同方向变异。迄今为止,与HPRS-103 的同源性最低的为1997 年从美国白羽肉鸡分到的毒株6827 ( 至86.6%)。在所有比较毒株间,最低同源性见于1997 年前从美国白羽肉鸡分离到的毒株6827 与2000 年从中国白羽肉鸡中分离到的IMC10200 株之间,只有83.7%。以后即使是从遗传背景相差很大的中国固有的地方品种鸡中的分离物,也没有超过这个差异。

3、ALV-J分离物中的准种多样性

3.1 病毒准种(quasispecies)的概率的提出及其应用

在RNA 病毒,特别是反转录病毒演变规律的现代研究中,必须注意准种的概念。这个概念最初是作为模拟地球上最初出现的大分子,如RNA的演化模型提出来的;随后又将病毒准种(viralquasispecies) 这个概念用于病毒研究,用它来代表某一病毒( 主要是某些RNA 病毒) 在同一个宿主体内大量复制后形成的群体基因组遗传多样性。由于RNA 聚合酶在RNA 复制过程中的自我纠正功能较差,一个病毒粒子经几十次复制循环后,很容易形成一个相互间极为相似但基因组上又有所差别的大量病毒粒子群体,在同一宿主体内这一病毒群体最初仅是由非常有限数量甚至只是一个病毒粒子复制而来的。其中序列单一的单个( 群) 病毒粒子称为准种中的变异体(variants),而准种是一系列基因组高度相似的各种变异株构成的病毒群体。( 编者注:在对生物体的分类描述中,也常用“variants”这一词表示种或株下的变种或变异株,但一个病毒样品中准种涉及到基因组分子的多样性,所以这里“variants”称为“变异体”)。

在过去20 多年中,在病毒准种这个概念上,以人的HIV (human immunodeficiency viruses) 作为对象研究得最多,主要关注的是患者的免疫反应及其选择压对患者体内HIV 准种群体演变的影响。ALV 作为家禽中最主要的反转录病毒,在过去几年中也开始对它的囊膜蛋白gp85 的准种多样性和演变,从不同的层次开展了系统研究,特别是在过去30 年中对养禽业危害最大的ALV-J。

3.2 ALV-J分离物中gp85的准种多样性

3.2.1 ALV-J分离物的PCR产物克隆的序列多样性

3.2.1.1 同一发病鸡群中ALV-Jgp85的多样性

通常,从同一鸡群同一时间分离到的同一种病毒都看作是同一株(strain) 病毒。但我国2009 年大批蛋鸡发生ALV-J 诱发的白血病后期,已注意到同一鸡群中同时分离到的ALV-J 的gp85 序列有一定差异性。例如,2012 年,从某地方品种鸡群从不同个体分离到的9 个ALV-J 分离物,它们gp85 的最低同源性仅为96.6%。但还有更突出的,2012 年,山东某海兰褐蛋鸡个体户的鸡群感染ALV-J 后的肿瘤死亡率高达30%,对同时从10 只感染鸡采血分离到的ALV-J 的PCR 产物克隆测序表明,这10 个病毒样品中ALV-Jgp85 的序列差异很大,其同源性在79.0%~96.8%,病毒间gp85 的最低同源性甚至低于表2 中过去30 年中147 个毒株间的最低同源性。

3.2.1.2 同一感染鸡体内ALV-Jgp85的多样性

不仅在同一感染群体内的ALV-J 显示出多样性,在同一只病鸡体内也显示出多样性。当用一遗传背景非常清楚的比较单一的ALV-J 病毒株NX0101接种5 日龄SPF 鸡胚后7 个月扑杀,选其中一只呈现全身肿瘤的鸡,分离不同脏器组织提取RNA,RT-PCR 产物克隆后测序,每个脏器样品取10 个克隆比较。如表3 所示,每种脏器的10 个克隆的gp85序列都不相同,相互间最低同源性只有96.7%,而且与接种的原始病毒的序列变异更大,最低同源性只有93.7%,而作为对照的经细胞传5 代的克隆与原始病毒的同源性均在99.1% 以上。这表明,即使是一个在基因组上比较单一的ALV-J 接种物,在易感鸡的体内经过长期无限多复制周期后,就可能发生很大的突变,在这一准种群内产生大量的多样性变异体。当然,并不是所有的变异体都能保存下来成为准种的一员,只有对感染宿主内环境适应能力强的变异体才有可能参与准种种群的组成。

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3.2.2 高通量测序显示ALV-Jgp85的准种多样性

如2.1 中所述,为了研究ALV-J 分离物中的准种多样性,可以对每一样品的PCR 产物都选用10个左右的克隆分别进行测序比较。但是,成本和人工操作都限制了测序克隆数量的进一步增加,更限制了对一个宿主体内某种病毒准种多样性及其演化过程真实面貌的了解,特别是不容易分析出准种中新的变异体的发生趋势,即如何从最初比例极低的变异体演变为准种中的优势群体。最近几年发展并广泛应用的高通量测序技术 则有助于解决这一问题,并促进对病毒准种及其演化规律的研究产生一次质的飞跃。高通量测序技术的优势是其数据量大,在相对较低的成本和应用较少人工的条件下,可显示同一测序样品中数十万个核酸分子的同一位点的不同序列,从而显示出准种的多样性及相关的变异体从优势到少数或从那些比例极低的变异体在准种群体中演化为优势变异体。利用这一技术并结合现代的生物信息技术,对一些易于变异的医学RNA 病毒的准种多样性已取得很多进展,最多的是在HIV 。此外,还有B、C、E 型肝炎病毒,人多瘤病毒、H1N1 流感病毒 及DNA 病毒带状疱疹病毒。研究人员探索了在抗病毒药物、在免疫选择压力下、在患者不同的病程期间这些病毒的准种的多样性,特别是一些优势准种及某些稀少准种演化规律,从中推断出与药物抵抗力、免疫选择压或病程相关的基因位点或区域。ALV 基因组上与准种多样性及致病性相关的是gp85 基因和LTR。高通量测序技术的优势是其数据量大,可显示同一测序样品中数万个核酸分子的同一位点的不同序列。虽然这一方法也有其局限性,即能够可靠读出序列的片段只有300~400 bp,但是,决定ALV 亚群及识别细胞受体的gp85 的高变区分别分布在几个200~300 bp 大小的片段内,而另一个重要的基因片段LTR 中最重要的3' UTR 区也只有300 bp,用高通量测序技术均可将如此大小的片段可靠读出。利用高通量测序技术,我们实验室分别对用NX0101 株ALV-J 接种的SPF 鸡中呈现持续性病毒血症的个体在2~36 周内分不同时间点分别采集血浆样品,从中提取RNA 后再分别用ALV-J 的gp85高变区A/B 的特异性引物做RT-PCR,进行高通量测序。对于高变区A 和B,对齐后序列长度分别为327 bp 和270 bp,平均每只鸡在每次采样时间点约有2.57 万~3 万条有效reads。每个样品中含有4000 种左右的序列不一的变异体序列单体,其中大部分为优势准种,每一变异体的比例都在1% 以上,最优势的可达10%~40%。在对2012 年从蛋鸡分离到ALV-J733 株接种不同品种鸡后的连续传代过程中,其准种的多样性也与此非常类似。显然,用常规的克隆测序技术是不可能得到准种多样性如此大的信息的。

本研究室在进行高通量测序的同时,用同一份样品的RNA 扩增了全长的env ( 包含gp85-A 和gp85-B两段) 基因片段,每个样品挑取至少20 个阳性克隆测序,以此来比较高通量测序平台的准确性。通过比较发现,常规测序和高通量测序在优势变异株的比例较高(>15%) 时,两者的结果比较接近;然而当优势变异株的比例较低时(<15%),两者的结果偏差较大。这显然与常规测序的克隆数较少相关。


4、ALV-J在不同选择压作用下的演变

4.1 ALV-J囊膜蛋白gp85在免疫选择压作用下的演变

在对ALV-J 的抗病毒免疫反应中,特别是病毒中和反应中,囊膜蛋白gp85 的作用最大。所以,自然把gp85 作为免疫选择压作用演变研究的主要对象。由于ALV-J 感染后,很容易在鸡群中产生既有抗体反应又有持续病毒血症的个体,这更容易促进病毒gp85 的变异,鸡体形成的中和抗体有可能促使产生能逃逸该抗体反应的毒株。

4.1.1 以分子流行病学分析为依据

对于病毒囊膜蛋白在免疫选择压作用下的演变,早期都是根据分子流行病学数据,即根据囊膜蛋白基因中核酸变异的有义突变(non-synonimous)和无义突变(synonimous) 的比(NS/S) 来判断。如果NS/S 比大于2.0,就认为有一定的选择压作用。对于HIV 和其他感染人的RNA 病毒,在这方面已有多篇论文发表。在感染鸡群中ALV-J gp85 在免疫选择压下的演变也有一些报道。但这种研究方法需要积累足够数量的流行毒株及其序列,而且也很难做更深入的研究。

4.1.2 在连续细胞培养上研究特异抗体对ALV-J的选择作用

本实验室首先采用在带有ALV-J 特异抗体的细胞培养连续培养传代相应的ALV-J 的已知毒株,并以没有抗体的同样细胞连续培养作为对照,获得了令人信服的数据,证明抗体可从病毒的准种群中选择出特定抗原表位发生变异的新的变异病毒,而且能准确地确定与之相关的抗原表位。如图2 所示,相对于不含特异抗体的对照传代的病毒,在带有ALV-J 特异抗体的细胞培养的连续30 代传代过程中,在特定位点发生突变的变异体逐渐成为准种群中最容易检测到的群体,而且3 个独立的传代系统的表现极为类似。

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4.1.3 高通量测序技术探索活体内ALV-J在免疫选择压作用下的演变

为此目的,本研究室采用ALV-J NX0101 株人工接种SPF 鸡,挑选3 只持续病毒血症且有抗体反应鸡和3 只呈持续病毒血症但无抗体反应鸡,在36周内的不同时间点采集血浆提取病毒RNA,利用高通量测序平台对gp85 的两个高变区A 和B 进行测序,获得了迄今为止ALV-J 准种方面最大的数据集,包含约300 万有效reads。生物信息学分析表明,宿主免疫选择压在显著提高ALV-J 的准种多样性的同时,也导致优势变异株的显著变化( 图3)。在有抗体反应的1 号鸡中,随着抗体反应的发生,感染早期的优势准种的比例逐渐下降( 图3 中的准种变异体A103),而一些在感染早期检测不到的稀少变异体却在16 周龄时成为比例最高的优势准种( 如图3 中的准种的变异体A103 和A102)。在同一期间,作为对照的没有抗体反应的5 号鸡血浆中的优势准种则几乎没有变化(A501 和A502)。分别对1 号鸡的早期和后期优势准种突变体的gp85 序列构建了2个传染性克隆,并用16 和32 周龄的血清做病毒交叉中和试验。结果表明,16 周龄血清与早期病毒的中和效价比对后期病毒的效价高50~100 倍;与此相反,32 周龄血清对后期病毒的中和效价又比早期病毒高40 倍。这表明同一只感染鸡在前期和后期产生的抗体的抗原表位特异性也已发生了显著变化,显示出感染鸡体内的病毒和宿主抗体反应的共演变。

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4.2 ALV-J gp85在宿主适应性选择压作用下的演变

在ALV 感染细胞的过程中,病毒表面囊膜蛋白起重要作用。显然,不同细胞表面的受体特异性也会对ALV-J 的gp85 演变有选择压作用。本研究室采用高通量测序技术也发现,当同一ALV-J 悬液分别接种鸡体或DF1 细胞培养后,在感染鸡血浆和细胞培养上清液中的病毒准种中的优势变异体的序列有显著差别。一是在鸡体内的变异体的单体型的数量显著高于细胞培养,推测这与在感染体内ALV-J 要适应不同类型的细胞有关,而在体外细胞培养中,ALV-J 感染的细胞类型非常单一。二是优势准种的序列显著不同,如在gp85 中包含高变区hr2 和vr3 的B 片段中,在感染鸡血浆中B 片段带有“LSD” 三肽重复序列的变异体的比例高达8.58%~8.60% 和85.31%~85.34%,显著高于原始接种物中2.78%~2.79%。但同一接种物在DF1 细胞上传代后,带有“LSD”重复序列的变异体的比例却显著下降至0.01%,甚至检测不到( 孟凡峰等,2015,待发表资料)。可以推测,gp85 的B 片段中的这个“LSD”三肽重复性插入序列与对体内某种易感细胞的识别作用相关。而在DF1 细胞培养中,这个“LSD”三肽插入片段在感染过程中作用不大。

4.3 ALV-J在抗反转录病毒药物作用下的pol基因的演变

鉴于反转录病毒的复制有赖于反转录酶,一些反转录酶抑制剂,如拉米夫定和齐多夫定(AZT) 就能表现出对HIV 这样的反转录病毒的抑制作用。ALV 也是反转录病毒,本研究室最近的研究也证明这2 种反转录酶抑制剂能抑制ALV-J 在体内和细胞培养中的复制,而且也能产生耐药性。因此,也有可能应用高通量测序技术来研究这些ALV-J 的编码反转录酶的pol 基因在这些药物作用下的演变,特别是ALV-J 的感染鸡可以作为研究HIV 对药物产生耐药性的动物实验模型。以此为目标,本实验室正开始实施一个国家自然科学基金项目。


5、ALV-J的非编码序列LTR的多样性及其演变

与其他反转录病毒相同,ALV 基因组两端也有LTR 的成分作为前病毒cDNA 整合进宿主染色体基因组的必要功能元件,而且其中还包含有多个与转录活性相关的启动子、增强子等调控元件。ALV 的LTR 也是很容易发生突变的部位。早期本研究室在对白羽肉鸡的ALV-J 分离株的LTR 做序列比较时就已发现其多样性,有多种多样的插入或缺失性片段( 图4),而且当时获得的中国分离株在LTR 的“E”区都有一个共同的127 bp 缺失性突变,与美国1997 年前分离的4 827 株完全相同,把它作为中国ALV-J 来源于美国的最有力的证据。这一缺失性突变后来在蛋鸡分离物中也得到证实。在2006 年从患有典型髓细胞样肿瘤的蛋用型鸡群分离到的2 株ALV-J 的LTR,表现出完全不同的另一位点的缺失性突变。在2008 年我国蛋鸡中大批流行ALV-J 后,有更多的学者对LTR 进行研究,揭示出ALV-J 流行株的LTR 有许多不同缺失性或插入性突变。LTR 的突变很可能与致病性相关,但这方面的系统研究还有待深入。

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6、结论

ALV-J 是最易发生突变的病毒之一。在它最初流行的10 多年里,基本上只在白羽肉鸡中流行,而且以骨髓细胞瘤为最主要的病理变化。但是,在最近10 多年在我国的流行中,它又逐步适应蛋用型鸡、黄羽肉鸡及多种我国固有的地方品种鸡,而且发病的类型,特别是涉及到的肿瘤的细胞类型也逐渐多样化,传播性及发病致肿瘤率也显著上升,这显然与病毒的演变有关。现代生物技术为进一步深入研究ALV-J 的多样性及其演变提高了更好更有效的平台,这将有助于更深入理解其流行规律,从而为采取更有效的预防控制措施提供更可靠的技术支撑。

专家介绍
崔治中 

作者介绍:崔治中 :博士,教授,博士生导师,国际知名禽白血病首席专家,2013年度中国工程院院士有效候选人。现任山东农业大学兽医学博士后流动站、预防兽医学博士点负责人。

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