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表达禽流感病毒血凝素基因的重组禽痘病毒的构建
  

为构建表达禽流感病毒( AIV )血凝素( HA)基因的重组禽痘病毒,将禽痘病毒启动子LP2EP2驱动的H7亚型AIV HA基因cDN A和大肠杆菌LacZ基因插入禽痘病毒疫苗株F-017的复制非必需区。经蓝斑筛选后,对重组病毒又进行了3次蚀斑克隆。以不同代次重组禽痘病毒核酸为模板,利用H7亚型AIV HA基因特异的引物进行聚合酶链式反应,均扩增出1条特异的1. 7kb DN A条带。收集不同代次的重组禽痘病毒细胞培养物进行免疫斑点试验,均检测到HA蛋白,表明H7 AIV HA在重组禽痘病毒中获得了成功表达。该重组禽痘病毒的构建为AIV 病毒活载体疫苗的研制奠定了基础。

禽流感( AI)是由正粘病毒科A型流感病毒引起的禽类的传染病,高致病力禽流感病毒( highly patho genic avia n inf luenza vi rus, HPAIV )的感染可导致鸡群75% ~ 100%的死亡率,我国《家畜家禽防疫条例实施细则》将HPAI列为第一类传染病。AIV变异频繁,血清亚型众多,给AI的防制带来困难。迄今为止, H5和H7两种亚型的HPAIV 导致AI暴发流行均给当地养禽业造成毁灭性打击,世界各地均严加防范。由于AIV 基因具有高度变异性,利用弱毒苗预防AI有突变为HPAIV 的潜在危险,而灭活苗成本高,并且会严重影响现有技术条件下的禽流感疫情监测,因此AI基因工程疫苗的研究势在必行。

AIV 的血凝素(hemag glutinin, HA)是主要的保护性抗原, H5和H7亚型的HA亚单位疫苗及能表达H5 AIV HA基因的重组鸡痘病毒均可对同一亚型的不同毒株(包括高、低致病力毒株)产生近100%的免疫保护性。本研究中,作为禽流感病毒活载体疫苗研制的第一步,我们构建了表达H7亚型AIV HA的重组鸡痘病毒。

1、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 毒株 禽痘病毒疫苗株F-017由美国加利福尼亚大学戴维斯分校Yilma 教授惠赠。

1.1.2 质粒 p UCH7是含有H7亚型AIV A /Af ri. Sta r. /Eng-Q /983 /79( H7N1)株血凝素基因完整cDN A的重组质粒, HA cDN A两端引入了BamHⅠ 识别序列。pSY538含有禽病毒早/晚期启动子LP2EP2, pSY681含有鸡痘病毒复制非必需区, pSC11含有完整的LacZ基因,均由美国加利福尼亚大学戴维斯分校Yilma教授惠赠。

1.2 方法

1.2.1 HA基因重组鸡痘病毒转移载体的构建 切取pUCH7中的BamHⅠ 片段( HA cDN A) ,非定向插入pSY538的Bam HⅠ 位点, PvuⅡ 酶切判断方向,正确插入方向的重组质粒命名为pSYH7。切取pSC11中的Bam HⅠ 片段( LacZ基因) ,非定向插入pSY538的BamHⅠ 位点, ClaⅠ 酶切判断方向,正确插入方向的重组质粒命名为pSY LacZ。切取pSYLacZ中的NotⅠ 片段,即LP2EP2启动的LacZ基因,插入p SY681的No tⅠ 位点,重组质粒命名为pSY781。切取pSY H7中的NotⅠ 片段,即LP2EP2启动的HA基因,插入NotⅠ 部分酶切的pSY781,构建成功的质粒大小约11kb。根据HA与LacZ的相对位置,将转移载体分别命名为TvA、TvB、TvC和Tv D (图1)。

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1.2.2 感染-转染 9~ 10日龄SPF鸡胚(哈尔滨兽医研究所SPF实验动物中心提供)按常规方法制备单层CEF,铺满80%时用于感染-转染试验。5ml培养瓶中按0. 01PFU /cell的比例加入用无血清培养基稀释的鸡痘病毒疫苗株FPV-017,置于5% 二氧化碳的37℃培养箱内5h,用无血清DMEM洗细胞3次。按脂质体转染试剂盒( Promega )说明书进行转染: 取5μg转染用质粒DN A加于500μl无血清的DMEM中, 混匀(溶液A) ; 取5μl脂质体加于500μl无血清的DMEM中,混匀(溶液B) ; 将溶液A和溶液B立即混匀并加于上述细胞培养瓶中,再加入2ml无血清的DMEM混匀后置于5% 二氧化碳的37℃培养箱内。16h 后,将培养液换为5ml 含有10% 胎牛血清的DMEM完全培养基,继续培养3~ 5d,直至出现80%~100%的细胞病变,收集上清及细胞,进行重组病毒筛选。

1.2.3 重组病毒的蓝斑筛选 上述培养物反复冻融3次,  102、103、104、105、106倍稀释后接种单层CEF, 16h后以含200μg /ml X-g al、1% 低熔点琼脂糖的营养琼脂取代无血清培养基,继续培养3~ 5d,挑取单个蓝色蚀斑。

1.2.4 重组病毒的蚀斑克隆 单蚀斑以 102、103、104、105、106倍稀释后接种单层CEF, 16h后以含1%低熔点琼脂糖的营养琼脂取代无血清培养基,继续培养3~ 5d,挑取单个蚀斑。

1.2.5 重组病毒的PCR鉴定 收集重组病毒感染的CEF, SDS-蛋白酶K法提取基因组DN A,以H7 HA基因特异的引物进行PCR。

1.2.6 HA基因表达产物的Do t-ELISA检测 检测用的抗体为102倍稀释的H7亚型禽流感病毒感染SPF鸡所得的多克隆抗血清,标记抗体为105倍稀释的碱性磷酸酶标记的兔抗鸡IgG( Sigma) ,按常规方法进行检测。

2、结果

2.1 重组HA 鸡痘病毒转移载体的构建

本研究中目的基因和报告基因的启动子均为鸡痘病毒启动子LP2EP2。SmaⅠ 单酶切转移载体可得2个片段,根据其大小可判断HA和LacZ的相对位置(图2)。小片段约为1.8kb者为Tv C, 3. 2kb者为Tv D, 5kb者为Tv B,出现约11kb大片段者为Tv A,本研究中未筛选到TvB。选TvD为转染用质粒。

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2.2 重组病毒HA 基因的PCR鉴定

重组病毒的首次筛选依赖其中LacZ基因的表达,挑取单个蓝斑以低稀释度再感染CEF。收取2、3、4代次的细胞培养物提取核酸进行PCR,均扩增出特异的1. 7kb DN A片段,表明HA基因已重组到鸡痘病毒基因组(图3)。

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2.3 重组病毒HA 表达产物的Dot -ELISA

收取2、3、4代次的细胞培养物进行Do t-ELIS A,结果均呈阳性,表明重组的AIV HA基因获得成功表达。

3、讨论

痘病毒(包括鸡痘病毒)作为较成熟的重组病毒疫苗载体已成功地用于多种病原免疫原基因的表达,并在接种机体后显示出良好的免疫原性。美国已研制出表达H5亚型AIVHA的重组鸡痘病毒,可对相同亚型同源或异源高、低致病力AIV 攻击提供100%的免疫保护。表达HA的重组病毒疫苗与常规灭活疫苗不同,不会导致针对AIV 核蛋白的抗体反应,而这种高度保守的核蛋白正是确诊鸡群感染AIV所采用的琼脂扩散和ELIS A方法的主要标记抗原,因此重组鸡痘病毒活载体疫苗免疫不会干扰AI的诊断和流行病学调查。重组鸡痘病毒疫苗是防制H5和H7亚型AIV目前最有希望、最具可行性的活疫苗策略。表达H7亚型AIV HA的重组鸡痘病毒尚未见有报道。

在重组病毒构建过程中,为了易于筛选,往往需要插入一个报告基因,但这对最终的重组病毒却不是必需的。本研究中, LacZ报告基因和HA目的基因均使用了相同的启动子LP2EP2,我们从几种方向的转移载体中选取了两个基因相串联且报告基因在目的基因上游的转移载体( TvD)进行转染,以期重组病毒在复制过程中通过启动子同源重组缺失LacZ报告基因,结果如愿以偿。在重组病毒筛选过程中,继首轮筛选出现典型蓝色蚀斑,其他代次重组病毒蚀斑均未呈现蓝色,但HA基因的PCR检测和HA表达产物的Do t-ELISA均呈阳性。这一过程的详细机制尚需进一步探讨。

专家介绍
陈化兰 

作者介绍:陈化兰,甘肃省白银市人,博士,研究员,博士生导师,动物传染病及预防兽医学专家。中国农业科学院兽医兽药学科"一级岗位杰出人才"。任世界动物卫生组织(OIE)生物标准委员会委员,OIE/国际粮农组织(FAO)禽流感专业委员会执行委员,OIE禽流感专家。中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室主任,国家禽流感参考实验室主任,OIE禽流感参考实验室主任

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