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禽脑脊髓炎琼扩抗原的研制与应用
  

摘 要 利用禽脑脊髓炎病毒( AEV) Van Ro ekel株和山东野外分离株,分别脑内接种1日龄SPF雏鸡,在隔离器中饲养,取典型发病鸡脑、胃肠和胰腺等制备琼扩抗原。通过特异性检查、效价测定、与进口抗原及血清对比、田间试验等证实,该方法所制备的抗原性能稳定、效价高、特异性强,可广泛用于AE抗体的普查,适合于评价免疫鸡群抗体的水平。

1、前言

禽脑脊髓炎(简称AE)是由AEV引起的主要侵害雏鸡的急性传染病。该病可使1月龄以内雏鸡发生共济失调、头颈震颤、衰竭死亡等,成年鸡生产能力、产蛋率和种蛋孵化率降低,危害极大。世界许多养禽国家和地区均有此病报道。我国自80年代初发生该病,目前已传播到全国大多数省、市、区。山东省自1990年爆发该病,目前遍及全省,且危害严重。

AE的特异性抗体监测方法主要有: 病毒中和试验( VN)、鸡胚敏感试验( EST )、琼脂扩散凝集试验( AGP)、免疫荧光( FA)和酶联免疫吸附试验( ELISA)等。但目前最常用、最方便的方法是AGP。Luker t等人( 1971)利用AEV 感染后的鸡胚胃肠研制琼扩抗原,Mstsumofo 等人( 1977)用聚乙二醇( PEG)、三氯三氟乙烷抽提鸡胚脑中病毒,皆因含有大量非特异性蛋白,两种方法均未得到运用。Girshick等人用三氯三氟乙烷从感染AEV 的鸡胚中提取病毒作抗原,获得了成功,但制备成本太高。我国朴钟珠( 1987)、姚大明( 1988)、秦爱建( 1994)、赵心力( 1995)等人也对AE琼扩抗原进行了研制。

本实验利用AEV 感染SPF鸡后的脑、胰、胃肠等制备AE琼扩抗原,并在对非特异性处理上获得了一定成功,现报告如下:

2、材料和方法

2.1 材料

2.1.1 毒株 AEV Van Ro ekel 株由美国ATCC引进,经SPF鸡胚传代EID50= 105. 5 /0. 2毫升。AE野毒株系从聊城自然发病鸡脑中分离经SPF胚传5代,为胚脑悬液, EID50= 104. 2 /0. 2毫升。上述均- 40℃保存。

2. 1. 2 SPF种蛋 山东家禽所SPF鸡场提供。

2.1.3 SPF鸡 利用SPF种蛋在严格消毒的孵化器内孵化至出雏,饲养在隔离器中。

2.1.4 AE AGP诊断抗原和血清 购自美国SPAFAS公司。

2.1.5 SPF鸡血清、AE阳性血清 自制。

2.1.6 类症阳性血清及抗原 鸡新城疫病( ND)、鸡传染性法氏囊病( IBD)、鸡腺病毒病( ADV )、鸡传染性支气管炎( IB)、鸡马立克氏病( MD)、鸡减蛋综合症( EDS- 76)等标准阳性血清及相应的抗原,主要为自制,部分购自哈兽研、中监所。

2.1.7 隔离器 自制。

2.1.8 琼扩制备所需用品 优质琼脂粉由日本生产、上海分装。常规配制0. 01M PBS( p H7. 2)。

2.2 方法

2.2.1 抗原制备 用AEV V R株和聊城分离株第5代胚毒( S5 ) 10倍稀释后,脑内接种1日龄SPF雏鸡0.03毫升/只,饲养于隔离器中。取典型发病鸡的脑、胃肠和胰称重后,用玻璃匀浆器研磨,按1∶ 4加入无菌PBS缓冲液,冻融3— 4次,超声波处理, 3000r pm 离心30分钟。取上清液加等量氯仿充分震荡, 4℃作用2小时,3000rmp离心30分钟。取水相,加入化学药品去除非特异性,用生理盐水或PBS 透析,然后用固体PEG6000浓缩至1 /20左右,作为待测抗原。

取15日龄SPF鸡脑、胃肠和胰作同上处理,作为正常对照。

利用AEV Van Ro ekel卵黄囊接种6日龄SPF鸡胚, 37. 5℃孵化至16日龄,取发病鸡胚脑、胃肠等同上处理。同时设正常SPF鸡胚组织对照。

2.2.2 AE阳性血清制备 用本所研制AE油乳剂灭活苗免疫3月龄SPF公鸡( 1. 0毫升/只) ,隔离饲养1周后,加强免疫( 1. 0 毫升/只)。二免后两周,用美国AGP抗原检测。采阳性鸡心血,制取血清备用。

2.2.3 琼脂扩散试验 琼脂板制备: 称取优质琼脂粉0.8克,加适量pH7.2的0.01M PBS溶液,加热完全溶解后加NaCl15— 20克,补PBS至100毫升,溶解后四层纱布过滤,待50— 60℃时,倒入平皿中,每平皿17—18毫升,厚度3毫米,凝固后, 4℃贮存备用。

加样与判定: 按常规用梅花形打孔器打孔,孔径4毫米,孔距3毫米。按常规加入待检抗原(血清)与血清(抗原) ,置37℃温箱湿盒中, 24小时首次判定,观察至72小时,记录结果。抗原分别与标准阳性血清或待检血清出现沉淀线者为阳性反应。

2.2.4 免疫鸡群的检查 按本课题组建立的AE油乳剂灭活苗制备规程制备疫苗,分别对两个种鸡场进行种鸡免疫,在免疫后第1周、2周、3周、4周、15周、40周分别采血分离血清,测AE抗体水平。所有鸡血清冷冻保存。

2.2.5 疾病普查 收集多个鸡场血清。

2.2.6 利用美国AE AGP抗原作对比试验。

3、结果

3.1 雏鸡、鸡胚感染情况

3.1.1 SPF鸡感染后症状 脑内接种1日龄SPF鸡AEV· V R株或野毒株S5 ,均在接种后7— 9天后发病,出现AE典型症状: 精神沉郁、目光呆滞、共济失调、头颈震颤、后趾麻痹、倒地不起、饮食困难,最后,大多数鸡衰竭而死。

3.1.2 鸡胚感染后病变 剖检经卵黄囊接种AEV·V R的鸡胚。与正常SPF鸡胚相比,接种病毒鸡胚发育严重不良、胚胎卷曲、爪弯曲、腿肌肉营养不良,脑部水肿和肝脏呈斑驳样坏死等。

3.2 制备抗原检测结果

采用氯仿处理,并以PEG6000浓缩初步提纯的鸡源AE琼扩抗原,不论是AEV· V R株或野毒,均可与美国AE AGP阳性血清及自制AE阳性血清起反应,出现可见沉淀线,与SPF鸡血清无反应。正常SPF鸡相应组织所制抗原与AE阳性血清、SPF鸡血清无反应。野毒制备的抗原较VR株出现沉淀线早且明显。制备抗原1∶ 24稀释仍能与AE阳性血清反应,出现沉淀线。利用鸡胚组织制备的抗原与阴、阳性血清均无反应。

3.3 特异性检查

按方法中介绍制备的鸡源AE琼扩抗原与各种类症阳性血清如: ND、IBD、ADV、IB、MD、EDS- 76等无反应,而只与AE标准阳性血清反应。

3.4 免疫鸡群检测情况

检测结果表明,产蛋前种鸡免疫AE后,在20天左右可全部检测出抗体, AE抗体至少可持续到40周。

3.5 各地鸡群普查

从山东省的济宁、禹城、莘县、青岛等地和河北省馆陶、邢台、石家庄及北京市部分养鸡场的不同日龄鸡群抽检176份血清,其阳性率高低不等。其中: 山东省青岛地区阳性率最高(17/20) ,济宁(7/48)、莘县(9/34)、禹城(6/45)、河北(8/23)、北京(3/16)。同样采集SPF鸡血清60份进行AE抗体检查,结果全为阴性。

3.6 典型发病鸡群检查

取疑似AE的鸡群血清(聊城、枣庄某鸡场) ,AGP检测AE抗体,聊城5 /6阳性,枣庄13 /16阳性。

3.7 对比试验

利用SPAFAS生产的AE AGP抗原和自制AEAGP抗原检测待测血清43份,符合率100%。

3.8 应用实例

北京市兽医诊断所利用我们研制的AE AGP抗原,对北京市父母代种鸡场进行了流行病学调查, 350余份血清全部获得可信任结果。

4、小结与讨论

4.1 通过对制备抗原的特异性检查、效价测定、田间试验等证实,本实验所制备的AE琼扩抗原,特异性强,稳定性好,适宜于鸡群AE的抗体检查。

4.2 本试验利用鸡胚脑等制备琼扩抗原,未能成功,是否与病毒含量过少有关,有待于进一步分析。

4.3 用感染AE的SPF鸡组织制备琼扩抗原受多种因素影响。如脑内接种毒力、病毒量多少等。野外株较AEV· V R株更易制备抗原。另外,病毒接种量太多,易引起提前死亡,病毒来不及大量繁殖。我们曾用AEV·V R株病毒未作稀释接种1日龄SPF雏鸡24只, 6日龄发病,至9日龄,鸡群全部死亡,但利用该批鸡脑、胃肠等制备的抗原,效果不理想。

4.4 通过对全国部分省市AE流行病学调查,该病在山东省相当普遍。由于AE病毒对外界有较强抵抗力,难以根除,各地应认真做好预防工作,防止该病的爆发。受该病危害地区的祖代、父母代种鸡场应免疫AE,保证雏鸡在易感期不被感染。

4.5 从国内不同来源提供的AE AGP抗原,常出现对已知阴性血清有非特异性沉淀线。我们在研制过程中,也发现了类似问题,但经化学药品处理后,则非特异性消除。

专家介绍
赵继勋 

作者介绍:赵继勋,中国农业大学动物医学院教授,中国知名家禽疾病控制及预防专家。

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