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禽流感(H5 、H9 亚型)二价油乳剂灭活疫苗试验研究
  

本品系用A 型禽流感病毒A/Ostrich/Denmark/72420/96(LPAI -H5N2)株及A/Chicken/Shanghai/1/98(H9N2)株分别接种易感鸡胚、收获感染胚液、超滤浓缩后经甲醛溶液灭活, 加油佐剂混合乳化制成的油乳剂灭活疫苗。疫苗用4 周龄SPF 鸡作安全试验, 每只鸡肌肉注射2ml , 结果表明试验鸡均无全身症状和局部病变, 证明疫苗安全性良好。取疫苗一羽份免疫4 周龄SPF 鸡作效力检验, 免疫鸡全部获得保护, 对照鸡全部感染或死亡。经不同免疫剂量测定, 证明一羽份疫苗中至少含有8 个免疫剂量。免疫干扰试验证明两种抗原具有免疫协同作用。

禽流感(AI)是由A 型流感病毒引起的一种禽急性、接触性、烈性传染病。病毒广泛存在于野生禽、鸟类和人工饲养的禽类中, 国际兽医局(OIE)将其列为动物的A 类传染病。1878 年, 该病首次在意大利暴发流行, 当时称之为“鸡瘟” 。禽流感引起的损失主要有:高致病力毒株致鸡只的大量死亡;非高致病力毒株引起产蛋量下降, 免疫功能障碍而继发细菌或病毒的感染。1994年, 我国广东首次报道分离H9N2亚型禽流感病毒, 此后中国大陆的禽流感日益受到世人的关注。根据临床实践和已有的报道, 近几年,H9N2 亚型禽流感病毒已成为中国大陆当前禽流感病毒的主要亚型,H9N2 亚型禽流感病毒除引起上呼吸道症状、产蛋量严重下降外, 个别毒株还可引起较多的死亡。由H5N1亚型引起的禽流感在中国的报道最早见于1997 年香港, 死亡率极高,对鸡的危害十分严重, 2004 年初在我国大面积爆发, 现已几乎遍及全国各地。因此, 对这两种亚型禽流感的防制已成为当前禽病防制工作的首要任务。实践表明, 疫苗免疫是防制AI 爆发的主要措施、关键环节和最后防线。目前, 国内外用于预防AIV 的疫苗均为H5、H9 亚型单相灭活苗, 使用起来费时、费工,且对免疫鸡产生较大的应激, 为了使用方便、减少对鸡的应激, 在广泛开展禽流感疫情调查和病毒分离的基础上, 针对我国禽流感的流行状况, 我们进行了H5 、H9 亚型禽流感二价油乳剂灭活苗的研制工作, 现将主要研究成果报告如下。

1、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 毒种来源、培育及鉴定

制造本品用的A 型禽流感病毒A/Ostrich/Denmark/72420/96(LPAI -H5N2)株(简称D96 株)毒种由农业部动物检疫所从英国卫桥中心兽医实验室引进;A 型禽流感病毒A/Chicken/ Shanghai/1/ 98(H9N2)株(简称F 株), 由农业部畜禽传染病学重点实验室和农业部动物检疫所分离(中国预防医学科学院病毒学研究所国家流感研究中心鉴定)、保存和供应;效检用A 型禽流感病毒A/Chicken/Guangdong/1/01(HPAI -H5N1)株(简称GD 株),由农业部动物检疫所分离(中国预防医学科学院病毒学研究所国家流感研究中心鉴定)、保存和供应。

1.1.2 试验用鸡胚及鸡

SPF 胚:SPF 种蛋购自济南斯帕法斯SPF 鸡场, 在本所实验动物室孵化;SPF 鸡:将购回的SPF 种蛋在本所实验动物室孵化、出雏、饲养。饲料经 Co 60 照射消毒;饮用水为经过煮沸的常水。

试验用非免疫鸡及鸡胚:种蛋购自青岛康信种鸡场, 在青岛易邦生物工程有限公司兽用灭活苗生产车间的实验动物室孵化、饲养。

1.1.3 实验动物房及隔离器

健康SPF 鸡饲养及免疫试验在易邦生物工程有限公司兽用灭活苗生产车间3 号实验动物房(普通动物房, 该动物房通过农业部实验动物管理委员会验收)进行。攻毒试验在易邦生物工程有限公司兽用灭活苗生产车间3 号实验动物房(强毒动物房, 该动物房通过农业部实验动物管理委员会验收)进行。

LSL -III 型硬式不锈钢负压禽用隔离器, 由黑龙江灵农科技开发有限责任公司制造, 所有SPF 试验鸡均在不同动物房内的负压禽用隔离器内饲养。

1.1.4 禽流感油乳剂灭活苗生产用设备及试剂

由青岛易邦生物工程有限公司禽流感油乳剂灭活苗生产车间提供。

1.2 方法

1.2.1 抗体及EID50 检定方法

AIHI 测定方法参照“中华人民共和国兽用生物制品质量标准”。

1.2.2 制苗用病毒液的制备及检验

将D96 株、F 株毒种用灭菌生理盐水作适当稀释 ? ? ? ? ? ?(如10-4 或10-5), 分别尿囊腔内接种10~ 11 日龄健康易感鸡胚, 每胚0.1ml 。将24 h前死亡的鸡胚弃去, 此后每4 ~ 6 h照胚1次, 死亡鸡胚随时取出, 直至96h, 无论死亡与否, 全部取出, 置2~ 8℃冷却4~ 24 小时。分别收获鸡胚液, 在收取胚液前应对每个鸡胚仔细检查, 凡胎儿腐败、胚液浑浊及有污染可疑者均弃去不用。分别收获死胚和活胚, 每若干个鸡胚分为一组, 收取胚液并放入同一灭菌容器内, 每组抽样测定血凝价。血凝效价低于1∶128 者应弃去。同时进行无菌检验, 将检验合格的胚液置2~8℃保存备用。

1.2.3 灭活与浓缩于灭活罐内

将检验合格的病毒胚液混合, 计量加入10%甲醛溶液, 随加随摇, 充分混合, 甲醛溶液最终浓度为0.1%。加甲醛溶液后倾倒于另一瓶中, 以避免瓶颈附近粘附的病毒未能接触灭活剂。然后置37℃灭活18h 后取出, 置2~ 8℃保存, 灭活前留样备测毒价。在2~ 8℃条件下, 用超滤浓缩机将毒价合格且已灭活好的鸡胚病毒液浓缩至原体积的二分之一至三分之一, 抽样测定血凝价, 血凝价≥1∶512 时停止浓缩。

1.2.4 乳化与分装

将二种抗原液先分别乳化成单项苗, 乳化比例为1∶3(水相∶油相)。再分别将乳化好的AI H5、AI H9 亚型单项油乳苗等体积混合, 经匀浆机充分混合均匀, 即为二价苗。乳化后, 取3~ 5ml , 以3 000 r/min 离心15min , 若有分层现象, 应重复搅拌。定量分装。

1.2.5 成品检验

对实验室试制的疫苗抽检批号连续的三批疫苗0401 、0402、0403, 分别作物理性状、无菌检验等。

1.2.6 安全检验

用4 周龄SPF鸡10 只, 肌肉注射疫苗2ml , 观察二周, 并记录试验鸡的反应情况。

1.2.7 效力检验

用4 周龄SPF鸡或易感鸡(H5 和H9 亚型AIV HI抗体效价均≤1 ∶4)10 只, 每只颈部皮下接种疫苗0.5ml 。接种后21 d ,连同条件相同的对照鸡5 只, 分别采血, 分离血清, 再用A 型禽流感病毒H5 亚型抗原及H9 亚型抗原测定HI 抗体。

1.2.8 不同免疫剂量试验

将二价苗用不含抗原的白油进行倍比稀释, 取2 倍、4 倍、8 倍、16 倍稀释的二价苗分别免疫4 周龄的健康易感鸡于免后21 d 用强毒攻击观察并记录结果。

1.2.9 免疫干扰实验

将二价苗与具有相同抗原含量的同批单相苗分别免疫6 ~ 8 周龄的SPF 鸡, 于免后3 周分别采血, 测定H5 、H9 抗体效价。

1.2.10 与地方分离株的攻毒保护试验

二价苗免疫6 周龄健康易感鸡60 只, 免后21 d , 分别用山东、河南、江苏、河北、上海等地方分离的H5N1 和H9N2 亚型流行株进行攻毒保护试验。整个攻毒试验均在负压隔离器内进行。

2、结果

2.1 制苗用毒种检验

根据制苗的需要, 我们对两毒株进行了病毒含量、使用代次、纯净度及保存条件等系列检验。建立了A/Ostrich/Denmark/72420/96(LPAI -H5N2)株及A/Chicken/Shanghai/1/98(H9N2)株的种子批, 明确了毒种标准、鉴定方法、控制代数及保存方法。结果表明, 制苗用生产毒种的病毒含量、控制代次、鉴定结果等均符合要求。

2 .2 制苗用病毒液的制备试验结果

按1 .2 .2 的方法, 制备出了合乎要求的AIV H5N2 亚型D96 株病毒液和AIV H9N2 亚型F 株病毒液。经测定, 两种病毒液的病毒含量均≥107 .5EID50 / 0.1ml , HA 均≥1 ∶256。经无菌检验均符合制苗要求。

2.3 灭活试验病毒液

采用终浓度为0 .1 %甲醛溶液, 在37 ℃条件下灭活18 h 后, 取灭活病毒液接种10 -11 日龄鸡胚, 鸡胚全部健活且尿囊液均无血凝活性。盲传一代, 仍无血凝性, 证明灭活彻底。

2.4 实验室检验结果

2.4.1 疫苗物理性状检验 ?疫苗在2~ 8 ℃保存3 个月, 室温保存3个月, 疫苗不分层, 更长的保存时间有待于今后试验;37℃1 个月不分层, 二个月后疫苗表面有2mm 左右的油层, 摇荡后即成均匀的乳剂。

2.4.2 无菌检验 ?按“质量标准”的方法对三批苗进行无菌检验, 结果均无菌生长。

2.4.3 安全试验 ?用4 周龄SPF鸡, 肌肉注射疫苗2ml(4 羽份)。疫苗注射后部分试验鸡出现短时间的精神不振, 1 ~ 2 h 后即恢复正常。共观察3 周, 所有试验鸡精神、采食及饮水均正常。3 周后扑杀, 所有脏器未见异常。少数鸡注射部位有少量未吸收的疫苗, 但无肿胀溃烂。试验证明该疫苗安全。

2.4.4 效力检验 ?每批疫苗接种28 日龄SPF 鸡10 只, 皮下或肌肉注射0 .5ml/羽,同时设同条件对照鸡5 只, 观察21d 后, AIV H5 、H9 亚型HI 抗体几何平均值均≥9 Log2 。同时用AIVH5N1 亚型GD 株含毒尿囊液, 经10倍稀释后, 每只鸡静脉注射0 .2ml 。攻毒后10 d 内, 对照鸡全部死亡, 免疫鸡全部保护。用AIV H9 亚型F 株含毒尿囊液, 经10 倍稀释后, 每只鸡翅静脉注射0.2 ml , 10天后, 对照鸡病毒分离全部阳性, 免疫鸡全部保护。

2.5.5 不同免疫剂量试验 ?三批苗1/2、1/4 、1/8 、1/16 头份的攻毒结果达到了效力检验标准。2 .5 免疫干扰试验将H5、H9 二价苗与相同抗原含量的单苗, 分别免疫6 ~ 8 周龄的SPF 鸡各20 只,于免后21 天分别采血测定HI 抗体滴度, 结果表明, 二价苗的效价明显高于相应的单苗, 抗体效价为20 只鸡的几何平均值。

2.6 地方分离株的交叉保护试验 疫苗免疫后21 d , 分别用5 个地方分离株的病毒液, 作10 倍稀释, 经翅静脉注射免疫鸡, 每只鸡0 .2ml 。观察10 d , 结果表明, 除对上海株有一过性精神不好外, 用其它分离株攻毒后, 一切正常, 解剖后攻毒鸡也无禽流感特异性病变。可见,该苗抗原谱广, 免疫后可以抗击H5N1、H9N2 各地方分离株攻击。

3、讨论

3.1 禽流感是危害我国养禽业的主要疾病之一, 特别是2003 年底爆发禽流感以来, 养禽业面临严重的威胁。流行病学调查研究结果表明, 国内禽流感病毒的主要流行株是H5 和H9 两种亚型, 我国用于预防AIV 的疫苗均为H5 、H9 亚型单相灭活苗。使用起来, 费时、费工, 且对免疫鸡造成较大的应激, 为了使用方便、减少对鸡的应激, 我们研制出H5 、H9 亚型禽流感二价油乳剂灭活苗, 经临床应用, 试验结果证实, 二价苗免疫效力明显高于相同抗原含量的单苗, 这可能是两种抗原之间有免疫协同作用, 从而促进了机体免疫应答能力增强、抗体滴度升高。其作用机理, 有待进一步研究。

3.2 在二价苗研制过程中, 主要问题是抗原含量不足。在实际生产中经常出现免疫剂量不足而导致免疫失败或加大免疫剂量后导致吸收障碍的问题。本疫苗采用超滤浓缩技术, 使单位疫苗中的抗原含量增加2~ 3 倍, 在降低了使用剂量的同时提高了单位体积的抗原含量, 克服了常规技术制苗抗原量不足问题,减少了对免疫鸡只的应激反应。因此, 该二价苗较相应单苗免疫能产生更强的抵抗能力。

3.3 地方分离株攻毒保护试验表明, 该苗免疫后能抗击国内各地方分离株的攻击, 说明该疫苗毒株抗原谱广、免疫效力高。这可能是该二价苗免疫鸡后获得高保护的原因之一。

综上所述, 该实验建立了禽流感H5、H9 亚型的种子批, 选育的毒株免疫原性良好, 培育、增殖容易,纯度高, 适合作疫苗用毒株。所设计的生产工艺简便易行, 制苗材料来源广泛, 所制疫苗经物理性状检验、无菌检验、安全检验和效力试验, 结果都达到或超过原设定标准。证明该工艺合理可行。

专家介绍
李明义 

作者介绍:信得科技集团副总裁,研究院院长,河南农业大学学士和硕士学位,中国农业大学农学博士学位,中国动物卫生与流行病学中心生物技术研究室主任,国家诊断液制备中心专家,兼任河南农业大学、青岛农业大学教授(博士生导师)。

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