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传染性法氏囊病病毒衣壳蛋白与宿主CEF细胞相互作用蛋白的筛选
  

为筛选与传染性法氏囊病病毒(IBDV)衣壳蛋白VP2相互作用的宿主细胞蛋白,本研究以鸡胚成纤维细胞(CEF)为宿主细胞模型,VP2蛋白为诱饵,采用MatchmakerTM Gold系统,进行酵母双杂交试验。结果显示杂交效率为15%,所筛选的酵母总数为7.5×106个。回转验证等试验表明,有4种宿主细胞蛋白可以与VP2蛋白发生相互作用,本研究为深入研究IBDV的致病机制奠定了基础。

传染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)是由传染性法氏囊病病毒(Infectious bursaldisease virus,IBDV)引起的一种以感染雏鸡为主的高度接触性、致死性免疫抑制病。该病目前在国内表现为多种毒力毒株共同流行,在禽类传染病的防控中占有重要地位。IBDV属于双RNA病毒科、禽双RNA 病毒属,其基因组由两条双链RNA 节段组成,A 节段编码VP2、VP3、VP4、VP5蛋白,B节段编码VP1蛋白。VP2蛋白是病毒衣壳的唯一成分及主要的宿主保护性抗原,是病毒细胞嗜性、毒力等的重要分子基础。VP2一直以来是研究的热点,然而其与宿主细胞相互作用的机制尚未被全面揭示。本研究以鸡胚成纤维细胞(CEF)为宿主模型,采用酵母双杂交技术筛选与VP2相互作用的宿主细胞蛋白,为深入研究IBDV的致病机制奠定了基础。

1、材料与方法

1.1 菌株及主要试剂

IBDV Gt 株VP2 诱饵质粒(pGBGtVP2,简写为BD-VP2)及CEF酵母表达文库由本实验室构建并保存。Matchmaker TM       Gold酵母菌株Y2H Gold与Y187,质粒pGBKT7(简写为BD)、pGADT7(AD)、pGBKT7-53(BD-53)、pGBKT7-lam(BDlam)与pGADT7-T(AD-T),酵母培养基YPDAMedium、YPDA Agar、Minimal SD Agar Base、Minimal SD Base Medium、- Trp DO Supple?ment、-Leu DO Supplement、-Leu/-Trp DO Sup?plement与-Ade/-His/-Leu/-Trp DO Supplement,X-α-Gal,Aureobasidin A(AbA),酵母质粒转化试剂盒等均购于Clontech公司;酵母相关培养基按说明书进行配制。酵母质粒提取试剂盒购于Omega 公司。大肠杆菌DH5α由本实验室保存。其他试剂均为国产分析纯。

1.2 酵母双杂交

1.2.1 酵母双杂交

使用酵母菌株Y2H制备感受态细胞,并转化VP2诱饵质粒BD-VP2。转化后3 d,挑取单菌落于50 mL SD/-Trp液体培养基,250 r/min 30 ℃培养至OD600达到0.8。1 000 g离心5 min,弃去上清,酵母沉淀用4~5 mL SD/-Trp液体培养基重悬,进行细胞计数,确保酵母数量大于1×108个/mL。将诱饵菌株与CEF文库菌株混合,参照MatchmakerTMGold Yeast Two-Hybrid System User Manual 中方法进行酵母双杂交试验。将杂交后的酵母菌液均匀涂布于SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp(QDO)固体培养基平皿,30 ℃倒置培养。待菌落长出,挑取菌落划线于SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal/AbA(QDO/X/A)平皿继续培养,观察菌落是否生长及变蓝。

1.2.2 筛选酵母总数与杂交效率的计算

取出10 μL杂交后酵母的重悬液,倍比稀释至10-3和10-4,分别取100 μL稀释液均匀涂布SD/-Trp、SD/-Leu 和SD/-Leu/-Trp(DDO)固体培养基,于30 ℃倒置培养。待菌落长出,根据各平皿中酵母菌落数量,参照说明书中方法计算所筛选的酵母总数和杂交效率。

1.3 杂交结果鉴定

1.3.1 PCR鉴定及测序

挑取QDO/X/A平皿变蓝的酵母菌落,用生理盐水稀释后作为模板,使用引物T7SPU(5′-TAATACGACTCACTATAGGGCGA-3′)和3ASPL(5′-AGATGGTGCACGATGCACAG-3′)进行PCR 扩增。PCR程序为:95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 3 min,35个循环;72 ℃ 10 min。PCR产物由哈尔滨博仕生物公司进行测序,将结果进行BLAST比对,确定筛选所得宿主基因的相关信息。

1.3.2 酵母质粒的提取及扩增

挑取QDO/X/A平皿变蓝的酵母菌落,于DDO液体培养基在250 r/min 30 ℃条件下培养24 h。离心收集沉淀,使用酵母质粒提取试剂盒提取质粒,转化DH5α大肠杆菌感受态细胞进行扩增,提取阳性重组捕获质粒并保存。

1.3.3 回转验证

将阳性重组捕获质粒分别与VP2诱饵质粒和空诱饵质粒共转化酵母感受态细胞Y2H,并设立两组阴性对照(BD/AD、BD-lam/AD-T)和一组阳性对照(BD-53/AD-T)。将转化后酵母沉淀用100 μL生理盐水重悬,分别滴加于DDO、QDO、QDO/X/A平皿,3 d后观察平皿中酵母的生长情况并确定阳性克隆。判定标准:3种平皿上酵母均生长并且QDO/X/A上为蓝色者判定为阳性,否则判定为阴性。

1.3.4 生物信息学分析

将阳性克隆基因所编码蛋白质搜索uniprot数据库(http://www.uniprot.org/),获得其相关生物学信息。

2、结果

2.1 酵母双杂交筛选及序列分析

2.1.1 筛选酵母总数与杂交效率

文库酵母菌株与诱饵酵母菌株进行杂交,杂交酵母重悬液的总体积为12.5 mL,酵母总数为7.5×106个,高于有效数目(1×106个),杂交效率为15%,高于有效杂交效率(5%)。

2.1.2 序列扩增及分析

经加压筛选、PCR 扩增以及BLAST 序列比对,获得13种候选鸡源基因。


2.2 回转验证

候选文库质粒与VP2诱饵质粒共转化酵母感受态细胞Y2H,经验证共有4 个阳性克隆,其在DDO、QDO、QDO/X/A 平皿中的生长情况见图1。阳性克隆编码蛋白分别为鸡β-半乳糖苷结合凝集素(LGALS1)、真核细胞翻译起始因子4A3(EIF4A3)、平滑肌γ肌动蛋白(ACTG)和G蛋白β2多肽1(GNB2L1/RACK1),其相关信息见表1。

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3、讨论

本研究通过酵母双杂交方法共筛选得到4种与IBDV Gt 株VP2 蛋白相互作用的宿主细胞蛋白。其中,LGALS1是半乳糖结合凝集素家族的成员,其可能参与分化的调控。该蛋白可促进流感病毒(IV)吸附到靶细胞表面;艾滋病病毒(HIV)利用该蛋白增强其与CD4细胞的结合活性,从而加速病毒的吸附和感染;该蛋白可以减轻单纯疱疹病毒(HSV)感染所导致的眼部损伤。GNB2L1又称蛋白激酶C受体1(RACK1),是色氨酸-天冬氨酸重复序列蛋白家族的成员。有报道证明,RACK1可调节多种信号分子从而参与多种细胞活动,包括调节细胞周期、细胞分化、信号转导、蛋白磷酸化、细胞移动、吞噬以及Wnt通路、细胞凋亡通路等。A型流感病毒可以通过其基质蛋白与RACK1 相互作用完成病毒的释放;流行性腮腺炎病毒V 蛋白通过与RACK1 相互作用,导致STAT-1从α-干扰素受体复合物中释放出来。另外,ACTG可以与ATP分子结合,参与肌纤维的形成;EIF4A3 为ATP 依赖的RNA 解旋酶,是核质穿梭蛋白,参与形成外显子剪切复合物,ACTG 与EIF4A3 尚无与病毒相互作用的报道。深入探讨这些宿主蛋白与IBDV 衣壳蛋白VP2 相互作用的效应与机理,对于从病原与宿主互作层面了解IBDV 的致病机制具有重要意义。

专家介绍
王笑梅 

作者介绍:中共党员,博士,二级研究员,博士生导师。全国农业科研杰出人才,享受国务院政府特殊津贴专家。现任中国农业科学院哈尔滨兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心)党委书记、兽医生物技术国家重点实验室主任,兼任全国动物疫病防控委员会委员、中国免疫学会兽医免疫分会主任委员、畜牧兽医学会禽病学分会副理事长、国家肉鸡产业技术体系疾病控制功能研究室主任。

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