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传染性法氏囊病病毒反向遗传技术发展及其应用
  

摘要:传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)是双股双节段RNA病毒科的主要代表,其主要侵害鸡的中枢免疫器官法氏囊,引起的传染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)是危害养禽业健康发展的重要免疫抑制病。IBDV反向遗传技术诞生的近20年来,病毒拯救技术不断完善,病毒基因功能研究更为深入,而且基于此的新型疫苗的研究也有较大进展。本实验室在该领域也做了比较系统和深入的工作。本综述对IBDV致病机制和防控研究具有重要启示意义。

鸡传染性法氏囊病是由传染性法氏囊病病毒引起的一种主要危害雏鸡的急性、高度接触性、致死性、免疫抑制性传染病,民间有人称之为鸡的“艾滋病”,被世界动物卫生组织列为“影响社会经济的重要疾病”。该病于1957年首次暴发于美国,现已广泛流行于全球大多数养禽国家。该病1979年传入我国,最初仅引起5%左右的死亡率,至20世纪90年代,欧洲与中国相继出现了超强毒株(vvIBDV),致死率高达60%以上并引起更严重的免疫抑制。

IBDV有两个血清型,对鸡致病的血清I型毒株又分为经典毒株、变异毒株和超强毒株(very virulent IBDV,vvIBDV)。IBDV基因组包括两个双股RNA节段。A 节段有两个开放阅读框(ORF):小ORF编码非结构蛋白VP5;大ORF编码VP2、VP3和VP4蛋白。VP2是IBDV 唯一的衣壳蛋白,是IBDV主要的毒力基因和宿主保护性抗原。B节段编码具有RNA聚合酶活性的VP1蛋白。

反向遗传技术是研究微生物基因功能的重要工具。IBDV的反向遗传操作技术诞生的近20年来,病毒拯救技术不断完善,以此为基础的基因功能研究更为系统。关于IBDV细胞嗜性、毒力、复制等重要性状的分子基础,在病原学层面上已有较明确的结论。而且,基于反向遗传操作技术的新型疫苗的研究也有较大进展。本文对这些情况进行综述,分析该领域仍须重点研究的科学问题。

1、IBDV拯救系统

病毒拯救是病毒反向遗传操作研究的瓶颈技术。作为双股双节段RNA病毒,IBDV的拯救技术有其特殊性。

1.1 IBDV细胞适应株的拯救 

1996年,IBDV减毒株被首次成功拯救,开创了分节段双链RNA 病毒分子水平研究的新局面。所用的是体外转录拯救系统,即先把病毒全基因组克隆在T7启动子下游,利用外源T7RNA聚合酶将病毒基因组cDNA体外转录为RNA,然后通过转染病毒RNA而进行病毒拯救。Brandt等运用该系统进行嵌合病毒的拯救,通过电击转染将病毒RNA导入CEF或Vero细胞,然后将细胞悬液在鸡胚尿囊膜上传代获得嵌合病毒。体外转录因涉及到易降解RNA的体外操作不很方便。后来,又发展了基于T7RNA聚合酶的体内转录拯救系统,借助表达T7RNA聚合酶的痘病毒,或者直接表达T7RNA 聚合酶的细胞系,来提供病毒拯救所需要的T7RNA 聚合酶。直接转染cDNA 比转染cRNA 有更高的拯救效率。Boot等运用FPV/T7转录拯救系统成功拯救了IBDV减毒株CEF94。

真核细胞的RNA 聚合酶Ⅱ有良好的校正功能。虽然在表达量方面,RNA 聚合酶Ⅱ没有T7RNA聚合酶功能强大,但由于IBDV基因组相对较小,RNA聚合酶Ⅱ表达系统推测适用于IBDV的拯救。Lim 等将HK46株的基因组克隆在真核表达载体pALTER-MAX的CMV 启动子下游,拯救出了IBDV。2007年,祁小乐等成功构建了RNApolymerase II介导的IBDV 高效反向遗传操作系统。为了在转录水平上控制基因组的精确性,分别在减毒株Gt的基因组两端引入了锤头状核酶结构和丁肝病毒核酶结构。然后将带有分子标签和核酶结构的Gt株基因组A、B节段分别克隆在在真核表达载体pCAGGS的CMV 增强子和鸡β肌动蛋白启动子下游。将构建的两个重组真核表达载体在脂质体的介导下,直接转染DF1细胞,然后在CEF上传代,获得了IBDV 的拯救。该系统高效、简便、稳定。

1.2 IBDV细胞非适应株的拯救

目前,IBDV的现地流行株以超强毒(vvIBDV)为主。由于vvIBDV不适应细胞培养,反向遗传研究系统一直难以建立,极大地制约了致病机制的研究。以Boot为首的研究团队运用FPV/T7系统成功拯救了vvIBDV D6948株。将病毒基因组先转染QM5细胞,然后在原代法氏囊B淋巴细胞上增殖传代。然而,法氏囊B淋巴细胞的原代培养不太容易。余飞等利用RNA polymerase II介导的反向遗传操作系统,将DF1细胞转染产物直接注射入3~8周龄的SPF鸡的法氏囊器官内,在SPF鸡上盲传1~2代,即可实现vvIBDV的快速拯救。

2、IBDV细胞嗜性的分子基础

经典毒株、变异毒株和超强毒株等自然野毒株均不适应CEF等细胞培养,只有减毒株能在CEF等细胞上增殖]。Yamaguchi等研究发现,与亲代强毒株OKYM 相比,适应细胞培养的减毒株OKYMT在多聚蛋白上有5个氨基酸突变(VP2上4个,VP3上1个),故推测VP2与IBDV的细胞嗜性相关。Brandt等报道,细胞适应毒D78 的VP2被经典毒IM(不适应细胞培养)相应区段替换替换后,不再适应Vero和CEF。Boot等也有类似的研究结果,利用不适应细胞的D6948株和适应细胞的CEF株构建重组病毒,重组病毒srIBDVDACB(A 节段:D6948;B节段:CEF94)不能适应QM5,而srIBDV-CADB(A:CEF94;B:D6948)可以适应QM5,这说明A节段决定IBDV的细胞嗜性。当CEF94的VP2被vvIBDV D6948的相应部位替换后,该重组毒只适应原代法氏囊B淋巴细胞但不适应QM5。上述研究证明,VP2决定IBDV的细胞嗜性。

研究者进而对IBDV细胞嗜性的分子基础进行精细定位。研究发现,VP2的253和284位氨基酸与IBDV细胞嗜性相关。然而,关于单点突变是否能够改变IBDV 细胞嗜性,却存在争议。Mundt认为,单位点突变Q253H 或A284T不足以影响IBDV的细胞嗜性。van Loon等研究发现,单点突变A284T能改变vvIBDV UK661株的细胞嗜性而使其适应CEC细胞,Q253H 却无此效应。最近,祁小乐等从自然毒株和突变毒株两个角度系统证明,VP2的253/284协同突变是决定IBDV细胞嗜性的关键分子基础,单点突变无此效应。

关于VP2的279位氨基酸,Lim等认为双位点突变D279N/A284T可使vvIBDV HK46株适应细胞培养。然而,Brandt等的结果与此不同,将重组病毒rIMVP2(不适应CEF)的VP2中包含279、284和330位的片段用D78(细胞适应毒)的相应片段进行替换,仍然不能够适应CEF,说明三位点突变279/284/330不足以使IBDV适应CEF。祁小乐等研究发现,单点突变D279N、双点突变D279N/Q253H和D279N/A284T均不能改变vvIBDV Gx株的细胞嗜性。

关于VP2的330位氨基酸,Lim 等研究发现,单点突变S330R不能使vvIBDV HK46适应CEF细胞。Brandt等也认为,单位点突变S330R不能使强毒适应细胞培养,回复突变R330S也不能改变D78适应细胞培养的特性。研究还发现,在影响IBDV细胞嗜性方面,330位氨基酸也不能对253、284等关键位点起协同作用。

有些氨基酸位点,虽然不能决定IBDV 的细胞嗜性,但其突变却可能通过影响病毒的构象进而影响病毒的复制效率,譬如VP2的222位氨基酸、VP3的990位氨基酸等。

3、IBDV毒力的分子基础

3.1 基因组A节段与毒力的关系 通常,人们认为VP2是决定IBDV毒力的重要基因。Boot等研究发现,重组病毒srIBDV-DACB(A 节段:vvIBDV D6948;B节段:减毒株CEF94)与亲本毒D6948一样导致SPF鸡发病;srIBDV-CADB(A:CEF94;B:D6948)不引起任何临床症状和法氏囊病变,这说明A节段决定IBDV的毒力。减毒株D78的VP2被经典毒IM 替换相应部位后,重组病毒rIMVP2可致鸡法氏囊严重病变并有20%~25%的死亡率,说明IBDV毒力的分子基础主要在VP2上。

van Loon等将VP2的双点突变Q253H/A284T引入vvIBDV UK661,动物感染试验显示,突变病毒UK661-QH-AT组的鸡没有临床症状,而亲本拯救毒UK661rev的致死率为49%。病理切片也显示,UK661-QH-AT感染组仅在14dp.i.引起极轻微的法氏囊病变,而UK661rev引起的病变则很严重,这说明Q253H/A284T 使UK661的毒力显著降低。祁小乐等证明,双点突变Q253H/A284T可使vvIBDV Gx的致死率由60%以上降低为零,在另一个vvIBDV 毒株HLJ-0504上也有类似效果。另外,祁小乐等还发现,VP2的249或256位氨基酸也是IBDV 重要的毒力位点,三点突变Q249R/Q253H/A284T可以使vvIBDV 进一步致弱,不仅致死率降为零,而且感染鸡的法氏囊没有出现明显萎缩和损伤。

3.2 基因组B节段与毒力的关系

长期以来,B节段或VP1与IBDV毒力的关系被忽视。近十年来,越来越多的证据表明,VP1在IBDV的遗传演化中具有重要作用。最近,IBDV基因组的不同步进化和节段重组现象不断被报道。有些自然重组毒株基因组A 节段源自减毒株而B节段源自vvIBDV,它们仍然可以导致鸡发病和死亡,这提示B节段与IBDV毒力有关。研究者运用反向遗传操作技术证实了这一推论。进一步的研究揭示了其具体机制,VP1蛋白的4位、145/146/147位、276位氨基酸通过影响RNA聚合酶活性进而影响病毒的致病性和复制效率]。显然,IBDV的毒力是由基因组A 和B节段共同决定的。

4、IBDV的抗原漂变

作为RNA 病毒,在免疫等压力下,IBDV 比较容易变异。IBDV抗原分析的传统方法是交叉中和试验以及系列单抗介导的AC-ELISA 技术。2007年,Letzel等将反向遗传操作技术和系列单抗介导的IFA技术相结合进行IBDV抗原漂变研究,避免了传统方法中病毒分离和纯化等繁琐步骤。研究发现,IBDV抗原漂变正在发生;抗原漂变相关的氨基酸突变主要集中在VP2的突出区(P区);氨基酸的改变能够导致病毒的单克隆抗体反应谱的变化,但相应的规律仍不清楚;以单抗反应谱为基础的病毒抗原分型与其在基因进化树上的位置没有规律性对应关系。

5、IBDV新型疫苗的研究

目前,IBD活疫苗一般通过在鸡胚或细胞上盲传获得,费时费力,其结果有随机性,而且传代过程中可能伴随抗原性的变化。传统的疫苗株培育方法不能够完全满足疫病综合防控的需求。反向遗传操作技术,以其快速、精准等特点,在新型疫苗的研究方面大有作为。

5.1 VP5缺失或嵌合 VP5对IBDV的体内或体外复制是非必需的。据此,可以构建缺失VP5的IBD疫苗。Mundt等构建并拯救出了VP5缺失毒株IBDV/VP5-(VP5起始密码子ATG突变为精氨酸密码子AGG)。VP5缺失虽然延迟了病毒的复制与释放,但却不影响病毒的最终滴度。随后,Yao等以D78株为骨架拯救出了VP5缺失毒株rD78NS△,该毒株体内外复制也变得缓慢,但仍然能够激发宿主对IBDV的良好免疫强度。最近,秦立廷等以中等毒力毒株为骨架构建的VP5缺失病毒rGx-F9VP2△VP5对鸡的致病力显著降低,免疫后能刺激机体产生较高滴度的抗体和较好的免疫保护,且不造成对禽流感疫苗的免疫抑制。

IBDV血清Ⅱ型通常只感染火鸡但对火鸡不致病。秦立廷等用血清Ⅱ型毒株23/82的VP5替换减毒株Gt的相应基因,并且研制了针对血清Ⅱ型VP5的单克隆抗体,能够鉴别拯救毒rGt2382VP5与流行的I型毒株。这些VP5标记策略研究对于IBDV新型疫苗的研制有重要借鉴意义。

5.2 VP3嵌合 作为两个重要的结构蛋白之一,VP3也被用于嵌合病毒的研究。Boot以CEF94为亲本骨架,其VP3全长、N端部分、C端部分分别被将TY89(血清Ⅱ型)的相应部位替换,拯救出相应的3 株血清型嵌合病毒mCEF-s2VP3、mCEFs2VP3N、mCEF-s2VP3C。研究发现,VP3的N端部分比C端部分对病毒的复制影响大,其原因可能是由不同血清型VP3N 端高级结构的不同折叠造成的。与亲本拯救毒rCEF相比,mCEF-s2VP3C(VP3C端被替换)病毒释放时间有所延迟,但不影响其最终滴度。后来,Boot等又将血清Ⅱ型TY89的VP3C端部分嵌合进vvIBDV D6948,拯救毒致死率明显降低甚至不致死。针对血清Ⅱ型IBDVVP3的单克隆抗体可以鉴别拯救的嵌合毒和流行的I型毒株。VP3C端部分的不同血清型毒株重组,也是IBDV标记疫苗研发的一个重要思路。

5.3 VP2突变与重组 通过传代方法致弱的疫苗株虽然与亲本株比较接近,但仍存在不少氨基酸突变。与流行毒株抗原性越接近的疫苗保护效果越好。高立等以减毒株为亲本骨架,将其VP2用流行毒株替换,拯救毒rGtHLJVP2主要保护性抗原蛋白VP2仅在253和284位存在两个氨基酸的突变,与流行毒株基因特征更接近,对鸡无致病性,安全稳定,免疫效果良好,已经获得国家发明专利。最近,祁小乐等将vvIBDV 基因组A节段和弱毒株的B节段重组拯救获得一株病毒,其A节段特征与流行毒株更接近,仅在VP2上有三个氨基酸的差异(Q249R/Q253H/A284T)。该重组病毒rXATB对鸡无致病性,且能对致死性攻击产生完全保护。这些策略能较快的研制出与现地流行毒株匹配的疫苗株,对于疫病的综合防控意义重大。

5.4 表达外源短肽的重组IBDV 李凯等分别在VP2的PBC、pep7b和VP5区域插入新城疫病毒(NDV)HN蛋白的中和表位,拯救获得三株表达外源短肽的IBDV重组病毒。重组病毒可以诱导免疫鸡产生特异性抗体,对致死性攻击可产生70%~80%(IBDV)和50%~60%(NDV)的免疫保护。这提示,IBDV也有开发为疫苗载体的潜质。IBDV可以感染哺乳动物甚至人类,但对人类是安全的,已经被用于肝炎等人类慢性病的辅助治疗。将IBDV开发成为疫苗载体,有可能在公共卫生方面起到意想不到的效果。Upadhyay等首次评估了IBDV 表达外源表位的可能性。IBDVVP5 起始密码子后可以插入人丙型肝炎病毒(HCV)的表位短肽。在拯救的重组病毒中,HCV囊膜糖蛋白E的两个表位HCV(412~419)(8肽)和HCV(523~535)(14肽)均能和IBDV VP5蛋白融合表达。

6、问题与展望

随着研究的深入,我们对IBDV 有了更深层次更全面的了解。同时也发现了一些新的问题和研究方向。

IBDV的基因功能更加清楚了,然而研究发现IBDV的致病力不是由某个氨基酸、某个基因、某个基因组节段单独决定的,而是一个多因素的协同效应。继续完善基因功能研究,解析IBDV 基因组节段之间、各基因之间、编码区与非编码区之间的内在关系和协同机制,是全面了解IBDV 基因功能的重要组成部分。

基因变异从分子水平揭示了病毒的遗传变异,这些变异基因的功能发挥需依靠病毒蛋白的高级结构来实现。IBDV 强、弱毒的结构差异研究将有利于揭示病毒侵染宿主细胞的结构基础。

病毒性疫病的发生发展是病毒和宿主相互作用的结果。对于IBDV侵染宿主的分子机制研究,单从病毒角度研究是不全面的,另一个重要的方面就是宿主反应方面。IBDV 细胞受体、复制相关宿主蛋白、相关天然免疫的研究将有利于揭示不同毒力毒株侵染宿主细胞的差异及分子机制。

基于反向遗传操作等高新技术,将上述理论成果与疫病防控的实际需求相结合,建立和完善以主动设计和高效快捷为特点的疫苗研究新平台,研制与流行毒株更匹配的新型疫苗,将是未来动物疫苗发展和现代疫病防控的新方向。

专家介绍
王笑梅 

作者介绍:中共党员,博士,二级研究员,博士生导师。全国农业科研杰出人才,享受国务院政府特殊津贴专家。现任中国农业科学院哈尔滨兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心)党委书记、兽医生物技术国家重点实验室主任,兼任全国动物疫病防控委员会委员、中国免疫学会兽医免疫分会主任委员、畜牧兽医学会禽病学分会副理事长、国家肉鸡产业技术体系疾病控制功能研究室主任。

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