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表达禽网状内皮组织增生病病毒gp90蛋白的毕赤酵母基因工程菌发酵工艺优化研究
  

禽网状内皮组织增生病(RE)是危害养禽业的重要传染病,基因工程亚单位疫苗是防治该病的最佳选择。研究对表达REV主要保护性抗原基因gp90 的重组毕赤酵母基因工程菌株进行了发酵工艺优化,以实现重组gp90蛋白的高效稳定表达。发酵培养基、诱导温度和诱导酸碱度的优化结果表明,当诱导温度为28 ℃,诱导pH 6.0,基础盐培养基中CaSO4、MgSO4、K2SO4 3种硫酸盐的使用量降低至常用浓度的50%时,目的蛋白获得高水平稳定表达,表达的重组蛋白具有良好生物活性和稳定性。本系列优化试验为重组gp90蛋白制备基因工程亚单位疫苗的产业化奠定了基础。

网状内皮组织增生病(Reticuloendotheliosis,RE)是由网状内皮组织增生病病毒群(Reticuloen?dotheliosis virus,REV)的反转录病毒引起的禽类的一群病理综合征,包括急性网状细胞肿瘤形成、矮小综合征和淋巴组织与其他组织慢性肿瘤。近几年的流行病学调查显示,REV在我国鸡群中的感染已相当普遍,给养禽业带来了巨大的经济损失。

疫苗免疫是病毒性疾病防控的主要措施,但是目前国内外还没有成熟的商品化疫苗应用于RE的预防。REV可以整合至宿主基因组中,并可以在鸡群中垂直传播。从安全性和生产考虑,基因工程亚单位疫苗是预防该病的理想选择。本实验室在之前的研究中成功构建了表达REV保护性抗原基因gp90的重组毕赤酵母基因工程菌株。研究发现,酵母菌表达的重组gp90蛋白具有良好的免疫原性,免疫后可以诱导产生高水平的抗体并提供免疫保护。本研究在前期工作的基础上,对构建的表达gp90蛋白的重组酵母菌株的发酵参数进行了系统优化,旨在提高重组gp90的表达量和稳定性,为RE亚单位疫苗的产业化奠定基础。

1、材料和方法

1.1 菌株和抗体

表达REV保护性抗原基因gp90 的重组酵母菌株SMD1168-gp90 由本实验室构建和保存。抗gp90单克隆抗体由本实验室制备。

1.2 主要试剂和仪器

磷酸、硫酸钙、硫酸钾等购自国药集团化学试剂有限公司。酵母提取物、蛋白胨、葡萄糖等购自OXOID公司;YPD、MGY、基础盐培养基(BSM)参照Invitrogen公司酵母操作手册进行配制。发酵罐(BIOSTAT C plus,15L)购自德国贝朗公司;细胞数量在线分析仪(Biomass evo200)购自法国FOGALE biotech公司;紫外分光光度计购自Ep pendorf公司。

1.3 菌种的制备

将重组酵母菌种SMD1168-gp90划线于YPD琼脂平板,置于30 ℃生化培养箱培养72 h,挑取单克隆接种至50 mL YPD液体培养基(250 mL锥形瓶),置于30 ℃ 260 r/min恒温震荡培养至菌液OD600达到5~6时收获,1 000 r/min离心弃上清,将菌体重悬于MGY培养基,稀释至菌液OD600=1,置于30 ℃ 260 r/min 恒温震荡培养至菌液OD600 达到5~6时,以5%接种量转接至5L BSM培养基,进行发酵罐培养。

1.4 培养基的配制

配制用于发酵的基础盐培养基,每升含26.7 mL85% H3PO4,0.93 g Ca2SO4 ·2H2O,18.2 g K2SO4,14.9 g MgSO4·7H2O,4.13 g KOH,40 g甘油,10 g干酪素,1.5 mL消泡剂。将配好的发酵液加入发酵罐中,高压灭菌30 min。每升培养基加入2 mLPTM1(每升含:6.0 g CuSO4·5H2O,0.8 g KI,3.0 gMnSO4·H2O,0.2 g Na2MoO4·2H2O,0.02 g H3BO3,0.5 g Ca2SO4 ·2H2O,20.0 g ZnCl2,65.0 g FeSO4 ·7H2O,0.2 g生物素和5.0 mL H2SO4)。

1.5 重组菌株的发酵培养

重组酵母菌株的发酵分为甘油生长期、甘油补加期和甲醇诱导期3 个时期。甘油生长期以4%的甘油浓度使菌体生长至一个较高的密度;甘油补加期使用50%的甘油以15 mL/L·h的速度补加4 h;待甘油补加期结束且转速下降至300 r/min左右时开始进行甲醇诱导,开始维持甲醇补量为0.35%,维持4 h后将甲醇补量升至0.5%,随后根据甲醇的用量调节甲醇的补量,使甲醇浓度维持在0.5%~1.0%之间,维持甲醇诱导期48~120 h后收菌。每隔12 h取样检测菌体密度和蛋白浓度,绘制曲线。发酵完后,收获菌体,12 000 r/min离心10 min,收取上清即为蛋白样品。将蛋白样品于4 ℃保存。

1.6 发酵温度的优化

甘油生长期和甘油补加期维持发酵温度为30 ℃。进入甲醇诱导期后,分别调节发酵温度至26 ℃、28 ℃、30 ℃和32 ℃,维持上述温度至发酵结束。发酵过程中检测各时间点菌株生长情况和

1.7 发酵pH值的优化

甘油生长期和甘油补加期维持发酵pH 5.0。进入甲醇诱导期后,分别调节发酵pH值至3.0、4.0、5.0、6.0和7.0,维持上述pH值至发酵结束。发酵过程中检测各时间点菌株生长情况和gp90蛋白表达水平。

1.8 发酵培养基的优化

按上述方法进行菌种培养和发酵培养,在保持其他操作和控制不变的情况下,通过改变BSM培养基各种盐的浓度来优化适合该菌种生长的培养基配方。分别将基础盐培养基各成分的原始浓度按表1 进行优化,以确定最佳的培养基成分。在发酵过程中检测各时间点菌株生长情况和gp90蛋白表达水平。

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1.9 SDS-PAGE和Western blot

将收获的培养液上清采用10%分离胶进行SDS-PAGE。80 V 30 min,120 V 1.5 h。染色过夜,脱色后扫描。将蛋白胶用转膜液处理30 min,用Bio-Rad 半干转膜仪转膜(NC 膜),15 V 1 h。转膜完成后,将膜置于5%脱脂乳中于4 ℃封闭过夜。将膜用PBST洗3次,5 min/次。将膜用gp90单抗室温孵育1.5 h,同样方法洗3~5 次。将膜置于HRP标记的抗鼠二抗中室温孵育1 h,洗涤3~5次。用DAB显色液显色。

1.10 gp90蛋白表达量的检测

培养液上清的总蛋白浓度根据Bio-Rad蛋白分析试剂盒说明采用Bradford 法进行测定,以2 mg/mL 的BSA 作为蛋白标准品。根据Westernblot检测的蛋白条带以及薄层扫描结果确定目的蛋白gp90在总蛋白中的含量,并依此计算gp90蛋白在培养液上清中的浓度。

1.11 统计分析

所有数据以(平均值±标准差)表示,组间差异性用t-test软件分析,P<0.05表示差异显著。

2、结果

2.1 温度对重组菌株生长和gp90表达量的影响

使用基础盐培养基,对重组酵母菌株在pH 6.0,不同温度条件下进行甲醇诱导。由图1A可知,甲醇诱导72 h之前,菌体在28 ℃和30 ℃时生长状态最佳,但72 h之后,30 ℃培养的菌体密度开始下降,而28 ℃下培养的菌体密度进入生长的平台期。在26 ℃培养条件下,菌体密度在发酵过程中一直处于上升趋势;而32 ℃培养的酵母菌一直长势不佳,并在甲醇诱导48 h后停止生长。从菌体生长曲线来看,28 ℃为gp90重组酵母菌株生长的最佳温度。由图1B 可知,在28 ℃培养条件下,gp90重组蛋白的表达水平在甲醇诱导72 h后达到最高,为658.3 mg/L,显著高于其他培养温度下的gp90表达量(P<0.05)。

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2.2 pH值对重组菌株生长和gp90表达量的影响

使用基础盐培养基,对重组酵母菌株在28 ℃,不同pH值条件下进行甲醇诱导,每个pH进行5批次重复试验,甲醇诱导72 h后收获蛋白,检测gp90重组蛋白的表达量。由图2可知,重组酵母菌株在pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0条件下,gp90重组蛋白的平均表达量分别为456.8、406.14、372.48、658.34、578.32 mg/L。结果表明,pH 6.0是gp90蛋白在毕赤酵母中表达的最佳pH,该pH下gp90蛋白的表达量显著高于其他pH(P<0.05)。

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2.3 培养基成分对重组菌株生长和gp90蛋白表的影响

将重组酵母菌株在28 ℃、pH 6.0条件下,以不同的培养基进行发酵培养。由图3可知,只有基础盐培养基中主要3种硫酸盐(CaSO4、MgSO4、K2SO4)的浓度降低至原始浓度的50%时(201405批次),酵母菌株才可在发酵过程中稳定持续生长至发酵结束(甲醇诱导后120 h)。在使用其3种培养基配方时,菌株生长均提前终止;发酵后期罐内活细胞数目显著减少。蛋白浓度检测结果表明,201405批次发酵获得的重组gp90蛋白表达量显著高于其他批次(P<0.05)。Western blot结果显示,201405批次表达的重组gp90蛋白可以与gp90单抗发生特异性反应,表明其具有良好的反应原性(见图4)。将201405批次发酵获得的蛋白样品存放于4 ℃一个月后检测发现,gp90蛋白浓度没有发生明显变化,仍可与gp90单抗发生特异性反应,表明其具有良好的稳定性(见图5)。

3、讨论

近年来的研究发现,RE是引起感染鸡免疫抑制、生长缓慢、废弃淘汰率升高和污染禽用疫苗的潜在因素。上世纪90年代以来,RE在感染率、致病性和传播力上都发生了显著的变化,对养禽业造成了严重的经济损失。如今REV在我国分布广泛,持续流行,对养禽业危害严重,防控迫在眉睫。流行病学调查数据表明,疫苗污染已不再是REV感染的主要源头,而病毒的水平传播和垂直播可能是当前RE在现地流行的主要因素。研究表明,新型基因工程亚单位疫苗对于RE的预防安全有效。RE亚单位疫苗的应用将会对控制我国RE的流行起到重要的作用。

毕赤酵母(P. pastois)为真核表达系统,可实现与哺乳动物细胞相似的蛋白加工、折叠及翻译后修饰等功能。毕赤酵母表达系统遗传稳定性高,重组表达产物背景杂蛋白少,适用于高密度培养表达,是一种较为理想的真核表达系统。适于大规模发酵培养是毕赤酵母表达系统的优势之一,通过高密度发酵,重组蛋白可以获得高水平表达,从而实现亚单位疫苗的产业化。在进行发酵的过程中,发酵参数的选择和优化是实现重组蛋白高效稳定表达的关键因素。

本实验室在之前的研究中构建了成功表达REV主要保护性抗原gp90基因的重组毕赤酵母菌株。为了提高重组gp90蛋白的表达量并最终实现RE亚单位疫苗的工业化生产,通过对该重组酵母菌株的发酵条件在温度、pH值和培养基成分3个方面进行优化,确定了重组gp90蛋白在发酵条件下表达的最佳参数。

培养基的成分对微生物发酵产物的形成有很大影响,其中基础盐培养基是一种低成本的标准发酵培养基。针对不同的菌种,优化培养基的组成至关重要。先进的培养基组成和细胞代谢物的分析技术加上统计优化策略和生化研究对于建立能充分支持高产、稳产和经济的发酵过程是关键的因素。本研究通过将基础盐培养基中3种主要硫酸盐的浓度降低至初始浓度的一半,实现了重组gp90蛋白的高水平稳定表达。本研究不仅对RE亚单位疫苗的制备意义重大,而且对其他重组蛋白的发酵培养同样具有重要的借鉴作用。

专家介绍
王笑梅 

作者介绍:中共党员,博士,二级研究员,博士生导师。全国农业科研杰出人才,享受国务院政府特殊津贴专家。现任中国农业科学院哈尔滨兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心)党委书记、兽医生物技术国家重点实验室主任,兼任全国动物疫病防控委员会委员、中国免疫学会兽医免疫分会主任委员、畜牧兽医学会禽病学分会副理事长、国家肉鸡产业技术体系疾病控制功能研究室主任。

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