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抗犬细小病毒IgY的制备及其特性
  

用犬细小病毒(CPV)灭活抗原4次免疫SPF产蛋鸡,PEG沉淀法制备蛋黄抗体(IgY),IgY 产量达到56mg/枚鸡蛋,纯度达到88%。Westernblot分 析 表 明,IgY 抗 体 与 CPV 主要蛋白均发生反应。首 次 免 疫 后 7 周,IgY 的ELISA 抗体滴度达到1∶512000,中和效价达到1∶6400,稳定的抗体水平可持续到43周。本研究为IgY 应用于犬细小病毒病的免疫治疗和诊断奠定了基础。

犬细小病毒(canineparvovirus,CPV)病,以刚断乳至90日龄的幼犬多发,发病急,死亡率高(50%~100%),常呈地方 暴 发 性 流 行。犬细小病毒病的预防目前仍然依靠疫苗接种,临床治疗方法通常是在早期大剂量使用 CPV 抗体制剂与抗病毒药物及对症治疗等。抗体用于传染病的预防和治疗是有效的,其关键是能否获得大量的特异抗体。现 已 经证明蛋 黄 抗 体 (IgY)是 一 种 高 效、特 异 的 抗 体。IgY 以其化学性质稳定、产量高、成本低等特点,已经被广泛的用于病毒和细菌性疾病的防治与生物检测。本研究的目的是建立 CPVIgY 的制备方法,并对其生物特性进行分析,为IgY 在CPV 免疫治疗和诊断上的应用奠定基础。

1、材料与方法

1.1 细胞、病毒毒株与试验鸡 

FK81细胞,MDCK细胞,Vero细胞,CPV 毒株 YZ0701L 株,SPF 鸡(24周龄),均由本实验室提供。

1.2 试剂 

细胞培养基 DMEM 购自美国Sigma公司;新生小牛血清购自郑州佰安生物工程公司;兔抗鸡IgY(IgG)-FITC,羊抗鸡IgG HRP,购自 AbD公司;吐温-80,矿物油佐剂,由扬州威克生物工程有限公司提供。

1.3 病毒培养

CPV 接种到 FK81传代细胞,吸附30~60 min,加 入 1% PEC-DMEM 培 养 基 继 续 培养。每 天 观 察 细 胞 病 变 (CPE),培 养 3~4d,当80%细胞出现 CPE时,收获细胞和培养液。

1.4 CPV 的 提 纯

 CPV 毒 种 (YZ0701L)接 种FK81细胞,培养4d,待80% 细胞出现病变收获,冻融3次,10000r/min离心30min,取上清,加入终浓度分别为8% 的 PEG6000和3% 的 NaC1,室温搅拌2h,置4℃ 冰箱过夜。1800r/min,4℃ 离心2h,最后用少量的 PBS悬浮沉淀,测定病毒蛋白含量。

1.5 油乳剂灭活抗原的制备 

抗原1(病毒培养液抗原):CPV (YZ0701L)接种 FK81细胞,培养4d,待80% 细胞出现病变收获,冻融3次,4000r/min离心30min,取上清,加入0.1% 甲醛溶液,37℃ 灭活24h,4℃保存备用。抗原2(纯化病毒抗原)∶按1.4方法纯化 CPV,超离后病毒加入1/5原 体 积 的PBS溶解沉淀,加入0.1%甲醛 37℃ 灭活24h。抗原1和抗原2分别加入4% 吐温-80,1:3比例缓慢加入矿物油佐剂中7000r/min搅拌5min制备油乳剂灭活抗原(分别称为 CPV 灭活抗原1,CPV 灭活抗原2)。

1.6 试 验 鸡 免 疫 程 序 

已 开 产 的 SPF 试 验 鸡(24周龄),20只,均分为2组,10只/组,分 别 饲 养 于 蛋鸡笼中,试 验 共 进 行 4 次 免 疫。首 次 免 疫 (0 周),0.5mL/只,肌肉注射不加佐剂的灭活 CPV 细胞培养液;间隔1周进行第2次免疫(1周),1.5mL/只,两侧胸肌注射,一 组 注 射 CPV 灭 活 抗 原1,另 一 组注射 CPV 灭活抗原2;分别间隔2周后进行第3(3周),4次(5周)免 疫,免 疫 剂 量 和 方 法 同 第2次 免疫。

1.7 IgY 抗体纯化 

按 PEG 法做适当改进。先打开鸡蛋,去 除 蛋 清 分 离 出 蛋 黄,蛋 黄 按 1∶1 加PBS混匀,加入3.5% PEG6000,置磁力搅拌器上搅拌20min;8000r/min离心30min,取上清,按体积的8.5%加入PEG6000,室温20min;8000r/min,4℃离心30min,沉 淀 用 适 量 PBS 溶 解,按 12% 加 入PEG6000,再离心沉淀1次,PBS溶解恢复到原蛋黄的体积。IgY 溶液用0.25μm 过滤器过滤除菌,小量分装,-20℃保存备用。

1.8 IgY的蛋 白 含 量 与 纯 度 测 定 

纯 化 的IgY 抗体用 NANODROP2000核酸蛋白测定仪(Thermo)测定蛋白含 量。为 了 确 定IgY 的分子结构和相对分子质量,在还原条件下进行IgY 的SDS-PAGE电泳,考马斯亮蓝染色。使用Imagejge1分析工具测算IgY 纯度。

1.9 CPV抗体 ELISA检测 

抗体动态检测的方法如下:(1)PH9.6,0.5 mol/L 碳 酸 盐 缓 冲 液 稀 释CPV 提 纯 病 毒 抗 原,每 孔 包 被 100μL(1μg/孔),4℃,过夜。用含0.05%吐温-80的0.05mol/LPBS(PBST,PH7.2),洗5min × 3次。(2)10%犊 牛血清(PEC)PBS,150μL/孔,37℃,封 闭 1h,PBST洗5min × 3 次。(3)待 检 血 清,IgY 用 4% FCPBS(PH7.4)1∶100稀释,100μL/孔,37℃,1.5h。PBST 洗5min× 3次。(4)每孔加1∶4000稀释(用10%犊牛血清(PEC)PBST)的羊抗鸡IgG-酶抗体100μL/孔,37℃,1.5h。PBST 洗5min × 3次。(5)加入 TMB底物100μL/孔,作用(避光)15min。(6)2mol/LH2SO450μL/孔终止,立即酶标仪 D450读数。IgY 抗体效价检测时,将IgY 稀释到适当倍数,按上述方法测定 D450,计算 CPV 免疫前IgY 的 D450值的平均值(x)和标准差(s),以 D450≥x±3s确定IgY 抗体效价。

1.10 Westernblot分 析

 在 还 原 条 件 下 进 行CPV 的 SDS-PAGE 电 泳 (5% 浓 缩 胶,12% 分 离胶),随 后,转 印 到 硝 酸 纤 维 素 膜 上。纤 维 素 膜 用4% PEC-0.05% 吐温-PBS溶液摇床上室温封闭过夜,洗涤3次。加用1∶500稀释的 CPVIgY,37℃孵育4h,洗涤3次。加1∶8000PBST 稀释的羊抗鸡IgG HRP,37℃孵育1h。膜洗涤3次,TMB 显色 CPV 蛋白带,加纯水终止反应。

1.11 间 接 免 疫 荧 光 试 验 

CPV,CCV,CDV 分 别接种96孔板培养的 FK81细胞、MDCK 细胞和Ve-ro细胞,培养4d,出现明显CPE时,吸弃培养液,冷甲醇室温固定1h,PBS洗1次。加1∶500稀释的IgY100μL/孔,37℃,45 min;PBS洗3次,加1∶500稀 释 的 兔 抗 鸡 IgY(IgG)-FITC100μL/孔,37℃,45min,PBS洗3次;空干,倒置荧光显微镜下观察。

1.12 HA试验 CPV 

细胞培养液用 PBS(PH7.2)2倍连续稀释,加入1%猪红血球,4℃,3h或过夜观察结果,以完全血凝的病毒最高稀释度确定 HA 效价。

1.13 病毒中和试验

免疫后7周及其后不同时间收集鸡蛋,纯化IgY,用无血清 DMEM 培养基适当稀释,加等量 CPV(YZ0701L株)病毒悬液(含200TCID50/0.1mL),37℃作用1h;100μL/孔接种96孔微量板 FK81细 胞 单 层,每 个稀释度4孔,37℃吸附30min;补充100μL/孔无血清 DMEM 培养基,37℃ 5%CO2培养箱中培养4d;HA 试验检测培 养 上 清,中和效价以病毒完全中和

2、结果

2.1 免疫鸡 CPV 抗体应答

 血清、IgY 抗体动态,结果见图1。2种不同的CPV灭活抗原免疫后,抗体动态趋于一致,CPV灭活抗原2(含病毒蛋白42.0mg/L)免疫组稍高于 CPV 灭活抗原1组,但无显著性差异。免疫后1周IgY 抗体滴度低于血清抗体滴度,有滞后效应,但 免 疫 后5周 基 本 相 同,并 持 续 维 持 高 水平。CPV灭活抗原2免疫鸡4周的IgY 抗体滴度达到1∶256000,7周 达 到1∶512000,并 维 持 高 水 平(图2)。

2.2 IgY 产量与纯度

蛋黄经 PEG6000脱脂和沉淀处理,IgY 的产量平均值为4.8mg/g蛋 黄,本 研究中,每枚鸡蛋收获 的 蛋 黄 平 均 值 为11.7g,因 此,IgY 平均产 量 达 到56 mg/枚 鸡 蛋。在 还 原 条 件 下进行的IgYSDS-PAGE 电泳结果见图3,可见2条主要条带,分别是相对分子质量约70000 的重链和相对分子质 量 约25000 的 轻 链,与文献报道的类似。电泳图分析表明,IgY 的纯度达到88%。

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2.3 CPV蛋白SDS-PAGE与 Westernblot 

结果见图4,CPV 蛋白经SDS-PAGE电泳可见3条主要条带(vp1,vp2,vp3),相对分子质量分别 在82000,67000,64000 左 右,与 报 道 的 相 符。IgY 的Westernblot试验表明,IgY与3个主要条带均发生反应,证明IgY的特异性和多克隆抗体特性。

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2.4 间接荧光抗体试验 

IgY 检测 CPV 感染细胞的间接免疫荧光试验表明,IgY 具有 CPV 特异 性,见图5。抗体不与CDV、CCV感染细胞反应。

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2.5 病毒中和试验 

结果见图6,CPV 灭活抗原2免疫组,7周时纯化的IgY 具有高滴度的 CPV 中和活性,抗体中和效价达到1∶6400,高水平抗体可持续到首免后43周。

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3、讨论

传统的商品化多克隆抗体一般使用哺乳动物如小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊和马等通过免疫后获得血清来生产。由于难以获得大量的血液以及动物福利的担心,这些抗体尚不能工业化规模制备。自 从 杂交瘤技术被广泛采用用于制备单克隆抗体以来,各种各样的杂交瘤被克隆和大量培养,然而,由于成本太高,治疗性单抗的成功商品化依然困难。对 动物和人传染病免疫治疗的应用需要千克计的高纯化抗体。因此需要能大量生产抗体的经济有效的方法。IgY 抗体在成年鸡血清中的质量浓度大约5~7g/L,1个蛋黄含量在50~100mg。本研究中,IgY 平均产 量56mg/枚 鸡 蛋,按 每 年1只 母 鸡可生产 大 约 280枚 鸡 蛋 计 算 可 生 产 近 16gIgY。PEG 沉淀法制备的IgY 纯度达到88%,与国外试剂盒的纯化水平相当。经4次 CPV 灭 活 抗 原 免 疫后,纯化的IgY 能特异中和 CPV,首免后7周抗 体效价高达1∶6400,并能长期维持。低成本、大规模生产蛋黄抗 体 的 可 行 性 有 利 于IgY 用 于 犬 细 小 病毒病的免疫治疗目的。许多研究者进行大量的针对不同病原的IgY 研究证明,IgY 对肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌、耶尔 森 弯 曲 菌、ETEC 大 肠 杆 菌、鼠 和 牛轮状病毒以及牛冠状病毒感染小鼠、猪和牛能提供有效被动保护。

1996年,欧洲替 代 方 法 验 证 中 心(ECVAM)推荐使用IgY 代替哺乳动物IgG,以便降低侵入性抗体采样引起的动物痛苦。1999年,瑞士政府兽医局核准IgY 技术作为替代方法以 支持动物福利。与哺乳动物IgG 相比,IgY 不结合哺 乳 动 物 和 细 菌Fc受体,不激 活 补 体 系 统,也 不 与 类 风 湿 因 子 相 互作用。对高度保守的哺乳动物蛋白,由于抗原 来 源与鸡免疫系 统 的 遗 传 距 离 较 远,免 疫 应 答 更 强,因此,抗哺乳动 物 蛋 白 的IgY 生 产 比 目 前 使 用 兔、驴和小鼠生产IgG 更有效。此外,当哺乳动物蛋白用作抗原时,鸡抗体比哺乳动物抗体识别更多的抗原 表 位。本 研 究 中,Westernblot分 析 表 明,抗CPVIgY 能 与 CPV 衣 壳 3 种 蛋 白 VP1、VP2 和VP3反应,间接免疫荧光试验表明IgY 具有高特异性,ELISA 试验证明,IgY 抗体效价高;因此,IgY 也具有应用于犬细小病毒病临床诊断的潜力。

专家介绍
刘秀梵 

作者介绍:动物传染病学专家。出生于江苏省靖江市。1965年毕业于苏北农学院,中国工程院院士,中国畜牧兽医学会理事,动物传染病学分会副理事长。现任扬州大学兽医学院教授、博士生导师,国家重点学科预防兽医学学科带头人,农业部畜禽传染病重点开放实验室主任。

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