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猪瘟病毒流行病学 、病原致病特性及猪瘟综合防制研究
  

猪瘟是由猪瘟病毒引起猪的高度致死性、接触性传染病, 严重危害全球养猪业的重要传染病, 也是我国计划要消灭的重大动物疫病之一。 近年流行态势十分复杂, 本文就 CSF的流行情况、病原致病特征及综合防治技术研究等方面进行全面概述, 并为猪瘟的防制提出具体实施方案。

猪瘟又称经典猪瘟 (C lassica l Sw ine Fever,CSF),是由猪瘟病毒 (C lassica l Sw ine Fever V irus,CSFV)引起猪的高度致死性、接触性传染病, 是严重危害全球养猪业的重要传染病,是世界粮农组织和各国政府密切关注的主要传染病之一, 也是我国计划要消灭的重大动物疫病之一。目前 CSF遍布全世界 , 根据 OIE 制定的 《陆生动物卫生法典 》2005年版, CSF被列为法定报告的疫病之一 ,在我国被列为“一类动物疫病 ”。近 10年, 研究日渐深入 , CSFV 基础研究和 CSF综合防制研究取得了许多突破性进展。尤其在 CSFV 的流行病学、致病性方面也取得了重要成就 , 为我国 CSF防治工作奠定了重要的理论基础 。本文从 CSF的流行情况、病原致病特征及综合防治技术等方面进行全面概述 。

1、国内外 CSF的流行情况

根据目前各大洲和地区猪的饲养量 、猪与猪肉制品的国际贸易量以及该病的流行程度, 可将 CSF分为三大流行区 。东南亚 :东南亚养猪量约 5. 4亿头,占世界总量的 68%, 属老疫区, 由于控制措施不力 ,疫情仍然较重, 中国、印尼、越南和菲律宾是CSF流行最严重的 4个国家,所有东南亚国家在防制上均采用疫苗免疫兼扑杀措施;美洲大陆 :加拿大 1963年、美国 1976年宣布消灭 CSF 后, 这 2个

国家没有再爆发过 CSF,得益于美加两国采取了十分严格的控制措施。他们对任何动物及动物产品,特别是进口动物均采取了十分严格的检疫措施。疫情稳定, 疫病流行逐年减少 。欧洲:特别是几个欧共体国家 1990年以后均有 CSF 散发流行 ,是近年 CSF爆发的主要地区。 欧共体养猪业十分发达 ,猪的饲养量达 1. 17亿头 ,在我国之后排名世界第二。一直是世界上重要的活猪及猪肉产品出口地区, 产品远销世界各地, 特别是亚洲国家 ,所以近年来欧洲 CSF 爆发对全球 CSF 爆发有明显的影响。野猪是欧盟乃至整个欧洲 CSF爆发流行的祸根, 是欧盟国家爆发 CSF 的最重要传染源。根据流行病学统计资料 , 德国是欧盟发生 CSF最频繁的国家, 几乎年年爆发 。最大一次 CSF 流行始于 1993年 5月至 11月间 ,共爆发 100起 ,最初的传染源是感染野猪。德、法 、荷 、英、意 、比 、西、奥等欧共体国家和瑞士是 CSF 流行国, 密切注视这些国家疫情, 审慎地从欧共体特别是上述国家进口猪 、猪肉制品 、胚胎及精液等。

CSF是我国四大动物疫病之一 , 至今流行 70多年。我国于 1956年提出消灭 CSF的规划 ,虽然有效地控制了 CSF在我国的急性发生和大流行,但 CSF仍在我国不间断地流行 。其流行形式和发病特点已发生了很大变化 , 这种变化也是世界性的 。表现为 :流行范围广, 全国范围内均有 CSF流行 ;散发流行 ,疫点减少, 多局限于所谓 “CSF不稳定地区 ”的某些地区和猪场, 取决于猪群的免疫状态与饲养管理水平 , 且流行规模较小 , 强度较轻。但这种散发流行见于全国各地 ,加上我国巨大饲养量 ,所以其直接经济损失仍然十分严重 ;目前 CSF多发生于新生仔猪,发病日龄日趋偏小。成年猪很少出现发病症状 ,存在严重带毒现象 , 从我们复制的人工感染的持续带毒猪来看 ,可带毒 750 d, 还能引起水平传播、垂直传播并造成恶性循环 ;非典型症状和繁殖障碍型 CSF增多 :临床上 CSFV 持续性感染(亚临床感染 )和隐性感染增多 , 妊娠母猪带毒综合症 (繁殖障碍型 CSF)病例突出 , 这种感染种猪往往外表健康 , 是引起 CSF流行最危险的传染源, 应及时坚决淘汰 ;免疫失败现象严重 :养猪场十分重视 CSF 免疫注射 , 80%以上猪群均注射过兔化弱毒疫苗,但猪群免疫力低下却普遍存在 。母猪持续感染和仔猪胎盘感染是引起免疫失败的重要原因 ,这种母猪产下的仔猪多为先天免疫耐受猪,导致猪场形成 CSF恶性循环, 即 CSF亚临床感染→胎盘感染→母猪繁殖障碍 →仔猪带毒 →后备母猪 →亚临床感染, 使带毒率为 3% ~ 33%。

然而近几年来, 特别是今年夏季 6— 8月, 在我国南方高热高湿地区部分省相继发生了以高热为特征的猪病, 发病急 ,有的地区来势凶猛。从流行病学 、临床症状及病理变化等方面均表现出 CSF的典型特征 ,并且不同年龄 、性别和品种的猪均有发生 ,经调查, 均与 CSF 的发生有关, 同时还与猪繁殖与呼吸综合征、猪细小病毒病及猪链球菌和猪巴氏杆菌等细菌性疾病的混合感染 、继发感染有关。通过对我国 CSFV流行株的致病性分析表明 ,CSFV流行株在临床上的致病特征存在差异 , 临床上动物体内不同抗体水平对病毒的特异性影响,年龄、营养状况、饲养条件 、持续感染 、免疫耐受和环境因素等对病毒的非特异性干扰, 是导致发病特点表现出轻重缓急 、初次分离毒株表现不同致病力的原因 。系统进化分析充分说明我国 CSF流行态势十分复杂, 每一个行政地区 CSF 流行有多个传播来源 。系统进化分析还表明, 运输和贸易带来的猪群流动是 CSF在我国传播与扩散的重要途径 。因此认真贯彻疫情报告制度和流行病学调查的制度化,追踪每一起 CSF发生的来源及去向, 对 CSF防治具有十分重要的意义。

2、CSFV 分子流行病学研究

对欧洲 、美国 、巴西 、日本等不同地区分离的CSFV及先后 10年实验室保存的 CSFV 毒株, 利用抗 CSFV单抗进行研究, 发现其抗原性具有差异 。W ensvoozt等用 B rescia株免疫小鼠获得 13 株抗CSFV的 M cAb,对来自 13个国家的 94株 CSFV 的抗原差异进行了分析 , 还采用具有中和能力的M cAb筛选了逃脱中和作用的 CSFV 变异株。从1981— 1987年分离的 57株流行株中有 4种不同的抗原反应类型 , 其分布有一定规律性, 即时间相近的反应类型接近。另外, Kosm idou A 等用 12株E2 M cAb和 11株 E0 M cAb对 126株 CSFV进行了抗原分型, 结果 126株 CSFV 可被区分为 21种不同反应类型 。

Low ing s等1996年对 20多个国家不同时期的 115株 CSFV 的 E2和 NS5B基因的核苷酸序列进行遗传关系分析, 系统地将这些毒株划分为 2个基因群 , 5个亚群。涂长春等通过对中国流行的195株流行株 E2基因序列分析 ,显示目前中国流行的 CSFV 分为 2个基因群, 4个基因亚群 , HCLV株和 SM 株同属于组群 1 中的亚组群 1.1,而意大利强毒株 Brescia株位于亚组群 1.2。流行株与疫苗株差异较大, 流行株向远离疫苗株的方向演变。基因 1群与我国 1945年分离的石门强毒有很近的遗传关系,在我国 CSF 流行中占次要地位;基因 2群与欧洲流行株有较近遗传关系 , 在我国 CSF流行中占主导地位, 说明我国 CSF除自身传播来源外可能还有国外传播来源。根据毒株的遗传分型和来源绘制了我国第一张中国 CSFV 遗传多样性地理分布图 ,显示各基因群和亚群的分布无地理特点 ,与气候和季节无关 ,但明显地与养猪业的发展水平有关。全面阐明了中国 CSFV 的遗传变异及遗传多样性现状, 揭示了我国 CSF较为复杂的流行态势 ,表明猪群的随意流动是传播与扩散该病的重要原因。同时确立了分子流行病学研究在我国CSF流行病学调查中的重要地位。结果不仅对我国 CSF防制具有重要的指导意义, 而且填补了国际上 CSFV 分子流行病学研究缺乏中国数据这一空白, 对建立该病毒的全球监测体系具有深远意义。

3、CSFV 的病原致病特性研究

构建全长有感染性 cDNA 克隆技术平台已成为研究 RNA 病毒致病机理、致弱机理、蛋白功能、宿主嗜性和 DNA 标记疫苗的途径 , 尤其是在致病机理和毒力因素方面研究更 是活跃。 1996 年M oo rmann、Rugg li和 M eye rs等人首先构建了 CSFV感染性全长 cDNA 克隆,国内北京大学、武汉、长春和兰州等也构建了石门株和疫苗株的全长cDNA 克隆。 HulstMM 等通过对 C株基因组全长 cDNA中 E0基因的关键氨基酸 (297和 346位)的组氨酸突变成赖氨酸后, 获得了无 E0 RNase活性的病毒突变体 ,但仍能与 E0特异性的中和性单抗和多抗反应 , 也能抑制 CSFV 对 SK6 细胞的侵染 。细胞培养表明, 该突变体能使宿主细胞 (猪肾细胞 )发生 CPE, 引发凋亡, 因此推测 E0 蛋白的RN ase活性可能在病毒复制中可能发挥重要作用。

最近 , Von FreyburgM 等通过 E0蛋白 RN ase活性的缺失突变体研究 ,证实 E0 RN ase活性的缺失可降低试验猪的感染 。

CSFV编码 4个结构蛋白和 11个非结构蛋白 ,这些蛋白中 ,究竟哪一种或哪几种蛋白决定 CSFV毒力 ,一直是人们广泛关注的重要问题。研究者们利用构建的 CSFV全长有感染性 cDNA 克隆, 分别对 CSFV的 Npro、E0蛋白的功能作了深入研究 ,在CSFV蛋白质功能研究上取得很好进展。研究发现, CSFV 毒力并非由某一种蛋白决定, 而是多种蛋白共同作用的结果。 E2和 E0基因编码主要的囊膜糖蛋白 ,诱导机体产生中和抗体,因此,很多人把 E2和 E0基因作为研究 CSFV 毒力的靶基因 。R isattiGR等通过构建嵌和病毒 ,将疫苗株的 E2基因替换到 Brescia株相应位置 , 结果对猪的致病力明显减弱 ,在扁桃体的复制明显减少, 一过性病毒血症及病毒含量减少 ,表明 E2基因是影响 CSFV毒力的重要因素 。 Reimann I等采用 B resc ia株得到同样结果 。很快 V an Gennip, HCP等又对 B rescia株 E1蛋白羧基端进行了 19个氨基酸残基的插入突变, 结果所有感染突变体病毒的猪存活,病理变化减轻,病毒在扁桃体的复制减少 ,淋组织和血液中病毒滴度减少, 并且能够明显的低抗强毒攻击。研究证实了对强毒株 E1 碳端的突变是影响 CSFV毒力重要因素, 对活疫苗研制奠定了基础 。然而, V an G ennip HCG 等采用 B resc ia株细胞适应毒和强毒株之间进行位点突变所构建的嵌合病毒, 却证实 E2和 E0基因都不能单独决定CSFV毒力, 结构蛋白 (E0的 276S-R, 477T-I, E2的710L-H)和非结构蛋白 1195A-T, 1971S-P, 2638LV,3419N -I, 3858V-A)的共同突变可导致病毒毒力降低 。W id jo joa tmod jo, MN等人还构建了 2株E0基因缺失株,证明这些缺失病毒株可在 SK-6细胞中存活, 并持续感染和复制 ,但却不能释放具有感染性的病毒粒子。 G regorM eyers等人又利用突变的方法缺失了开放阅读框的第 346位 H is,导致 E0蛋白 RN ase活性消失, 病毒毒力降低 。虽然无 RN ase活性的 CSFV 在组织中生长特性与野生型病毒没有明显差异, 但与感染有 RN ase活性的CSFV相比 , 突变 RNase的病毒不能引起猪发病 ,并且外周血中的 B细胞数量并未减少 。突变 297位或 346位或者 2个位点同时突变 ,都可 RN ase活性消失 ,导致病毒毒力降低 。

除上述几种结构蛋白外, 非结构蛋白   Npro对CSFV 毒力也有影响。 D anie lM ayer等将 A lfort和 Eystrup2株病毒的   Npro蛋白缺失后发现, 虽然毒力大大下降 ,但仍可引起较强的抗体反应 ,足以抵抗致死量的强毒攻击 。将 Eystrup株的  Npro基因用Riem s株的   Npro基因替换 ,得到高毒力毒株 。可见,   Npro蛋白虽与毒力有关 ,但不是影响毒力变化的主要因素 。另外, Npro蛋白对干扰素调控因子 IRF3的转录具有抑制作用, IRF3的转录受到了影响 ,导致感染细胞内干扰素合成障碍, 使 CSFV 逃避了宿主细胞的免疫系统。

尽管上述学者采用 B rescia株对 CSFV 毒力特性进行了大量研究, 但全基因序列分析表明 B rescia株与我国流行株和疫苗株差异较大(89.4%和85.8%);我国分子流行病学研究显示, B re scia株位于 1. 1亚群, 是目前国际上流行极不活跃的亚群 ,与之同属的仅有的几个毒株为 1945— 1993年之间的意大利、捷克、美国和波兰的流行株 ,不适于揭示我国 CSFV 致病力特性的研究,我国进行毒力基因研究应采用近年活跃流行的具有本土特点的流行株和猪瘟兔化弱毒疫苗株 。

为了研究了我国目前 CSFV 流行毒株的致病特性,采用 9株临床表现高 、中、低致病特征的流行毒株在试验猪体进行连续 3 ~ 8 代传代 , 传代过程中临床致病力逐代增强并趋于稳定, 超过了标准石门强毒株的致病力 。试验猪出现较典型的 CSF临床症状 ,剖解后均表现出不同程度的病理变化, 各种脏器经 HCFA 检查均为强阳性。表明临床表现不同致病性的流行株 ,经本动物连续传代后均表现为强致病性 。对其中 7株流行株传代血毒部分代次 E2基因主要区域进行序列分析, 结果不同代次血毒之间没有一个碱基发生变异 ,说明 CSFV 免疫基因表现相对的稳定性 。利用荧光 RT-PCR 技术分析了传代中 CSFV 量变关系 , 明确了 CSFV 流行株经猪体传代后毒价的增高是导致致病力增强 、毒力回复的原因之一;同时明确了我国 CSFV 流行株在致病性上的一致性。在田间 CSF的临床表现和流行情况呈现多样化是多种原因综合影响的结果。

持续感染试验研究再现了 CSFV 持续感染的致病特征, 利用人工感染临床表现中等致病力 CSFV流行毒株并耐过的公母猪进行同居自然交配 ,导致 CSFV 在母猪体内能持续带毒 750d并不表现CSF临床症状;试验还通过这头持续感染带毒母猪诱导了 CSFV垂直传播和水平传播的致病特征 ,从分子水平证实 CSFV 导致的持续感染不但能通过母猪还能通过公猪垂直传播給仔猪 ,同时也能通过水平传播給同群易感猪 ;母猪所产木乃伊和死胎 、母猪难于受孕的状况以及母猪生殖系统的病理学变化 ,表明 CSFV 对种猪的持续感染是导致繁殖障碍型 CSF 发生的重要原因;公母猪同居配种后 ,检测 CSFV E2基因主要区域序列与公猪感染的毒株序列一致, 说明 CSFV 在猪体内繁殖存在一定优势选择现象。从理论上第一次证实了我国 CSF 长期持续存在的主要根源是田间猪群中广泛存在着无临床症状的 CSF持续感染带毒猪 ,特别是种猪群及后备种群中持续感染带毒猪的存在是造成妊娠母猪带毒综合征和仔猪先天带毒, 形成 CSF长期持续存在、发生 、发展和流行的恶性循环和免疫失败的主要根源 。因此彻底淘汰带毒种猪是净化CSF的重要措施 ,培育健康无持续感染的种猪和后备种猪是 CSF综合防制技术的核心。

4、我国 CSF的综合防治

通过对我国 CSF病原特性 、流行病学、分子流行病学、病毒持续感染机理和疫苗免疫学等方面进行了大量研究, 查明并掌握了我国 CSF长期持续存在的根源和多点散发流行恶性循环的规律和机理,也找到了消除 CSF 根源, 净化猪场、控制 CSF的突破口。针对我国当前 CSF的流行与发病现状以及养猪业规模化的特点 ,在我国消灭和控制 CSF不可能实行全部扑杀 ,只能采用逐步净化措施 。结合国情, 开展了一系列的 CSF 综合防治技术研究和应用。建立了一整套在我国切实可行的消除根源、净化猪场 、控制 CSF 的综合防治技术措施和防治模式,实施了规范的推广应用程序。

4.1 加强猪的科学饲养管理, 增强免疫应答能力

保证圈舍温度适宜, 养殖密度合理, 定期消毒 ,科学饲养, 确保猪的体质健康 。加强消毒, 做好基础防疫 。各饲养场、屠宰厂 (场 )、动物防疫监督检查站等要建立严格的卫生 (消毒 )管理制度;作好猪圈(舍 )、加工厂、用具 、车辆、粪便 、道路和人员的定期消毒并定期对消毒效果进行监测 。作好养猪场(户 )、加工厂的卫生、杀虫 、灭鼠工作, 减少CSFV 侵入的危险性。接种前认真检查猪只 ,凡是体质过于瘦弱, 未发生疫情地区的 60 日龄以内的仔猪, 怀孕 3个月以上 ,产后半个月以内的母猪及慢性病者,一般情况下均暂不注射疫苗 , 以后必须及时补免。另外接种后因猪只可能发生暂时性抵抗力降低现象,防疫人员应告知畜主 ,留心观察 ,加强饲养管理 ,对反应较重者可适当给予治疗。

4.2 科学免疫程序,实施强化免疫, 正确使用零时免疫

任何猪场、任何时候, 都不可能制订一个通用的免疫程序 。对 CSF 疫苗的免疫程序要根据当时当地的流行病史 、饲养管理和猪群的免疫抗体水平等因素综合考虑 。由于各猪场母猪群的免疫状态不尽一致,仔猪母源抗体消长规律也不相同 ,为获得较高的免疫保护率, 各猪场应建立免疫监测制度 ,了解母源抗体降低时间 ,选定首免日龄 ,从而制定个性化免疫程序,只有这样才能最大限度地降低母源抗体对免疫注射的干扰 。 “零时免疫 ”方法在理论上是可行的 ,因多数母源抗体不能通过胎盘进入胎儿体内 ,初生仔猪体内母源抗体极少 ,不足以干扰弱毒疫苗与免疫细胞的接触。 “零时免疫 ”能使 HCLV在体内有足够的增殖时间而不被血液中母源抗体中和,使仔猪尽早获得主动免疫 。但实际操作却难以实施 ,如母猪分娩过程可能拖长或者母猪晚上产仔 ,仔猪出生后已吮吸了初乳 , 疫苗稀释后保存时间过长等, 都会导致免疫失败 。因此 ,如何采用 “零时免疫 ”应把握好各个环节 。

当有效免疫率达 85%以上发生 CSF 机率较小 。注射后抗体达不到保护水平的应及时补种 ,如补种后抗体水平仍上不去的猪仔很可能发生了先天感染或免疫耐受 ,要坚决淘汰, 避免发生免疫失败现象 ,杜绝传染源。坚持定期对猪群抗体水平监测 ,制定科学的免疫程序十分重要。

4.3 强化监测制度,淘汰病原阳性猪 ,净化猪群

综合防治的关键技术是净化措施 ,采取以狠抓种猪群净化 ,培育健康种群为主的综合防控措施,定期以 HCFA 方法逐头检查种猪,及时发现并立即扑杀 ,加强免疫监测 ,建立新的无带毒健康种猪群 ,繁衍健康后代。病死猪、死胎 、胎衣等,应深埋做无害化处理。粪尿等要及时清除并经发酵处理 ,杀灭蚊蝇 ,定期灭鼠, 减少 CSF从疫源地造成的严重传播。经过多次反复净化后, 逐渐清除带毒种猪 ,并结合施以其他综合措施, 使 CSF 得到有效控制 。从 1997年至今,在我国 5个省市的 25个不同规模的集约化养猪场为重点 ,实施了 CSF净化措施 ,均取得了较好的效果。

4.4 自繁自养 ,全进全出

尽管临床上存在着不同致病特性的流行株,但通过本动物不断传代均可使致病力回复或复壮,甚至超过 SM 株致病力, 并都稳定在较强程度, 这种现象提示某些 CSFV 毒株在猪群中持续存在时如果经连续传代, 致病力会慢慢增强 。因而养猪场严格执行“全进全出 ”制的饲养模式是相当重要的 。同时 ,为避免由于引种不当造成的外来 CSFV 感染,应尽量做到自繁自养 , 并对不同饲养阶段的猪要全进全出 ,至少要做到产房和保育舍全进全出 。如必须引种 ,要慎重选择 , 对引入的种猪进行定期监测 ,待检测确无 CSFV 感染方可与其他猪混养。

4.5 坚决贯彻执行 “中华人民共和国动物防疫法 ”及相关法规

建立了一系列我国控制 CSF 的综合防治方案,制定了国家标准 《猪瘟检疫技术规范 》, 形成了农业部《猪瘟防治技术规范(报批稿 )》,起草了 《猪瘟综合防治技术措施 》。认真贯彻 《动物防疫法 》相关技术规范, 提高防疫人员素质 , 进一步普及CSF防疫知识 , 使兽医防疫 、检疫, 使防制 CSF工作走向法制管理的轨道 。对基层防疫人员要定期或不定期组织技术培训 ,促进知识更新, 提高业务素质 ,同时可利用广播、报刊、电视等宣传工具 ,广泛宣传 CSF防疫知识和重要性 , 使群众受到科普教育 。

4.6 加强猪瘟流行病学信息的统一管理和分析手段,建立科学的疫情预测预报系统

为了加强对 CSF 流行病学信息的统一管理 ,随时掌握全球 CSF数据,分析 CSF传播来源, 进行疫情预测预报。 “十五”期间由中国兽医药品监察所、军事兽医研究所和中国动物卫生与流行病学中心建立了第一个 CSF 流行病学信息系统 (CSFin-o)。 CSFinfo统一管理, 统一更新, 保证信息的全面系统性;使用地图信息显示方式,全面、准确的反应毒株在不同地点 地/ 区的分布状况;使用多种统计图、表灵活的展示当前和历史的各种统计分析数据 ,方便全面了解流行毒株的发展变化规律;CSFinfo系统中数据库完成了空间数据的管理、共享,CSF info系统通过 w indow s文件关联功能建立了与DNAStar6. 0 序列分析软件的关联, 实现了对流行毒株遗传距离进行实时分析的综合应用。 CSFinfo的建立对我国 CSF的流行病学监测提供了必要的技术基础。随时掌握流行毒株的遗传变异 ,监控新毒株或新变异株的流行 。提高对 CSFV 流行毒株总体分布、疫情发生发展趋势的科学了解和掌握,提供科学的数据统计分析手段;提高对 CSFV 的研究分析质量、降低决策风险。为政府 CSF 防控提供可靠的疫情资料具有十分重要的意义。

专家介绍
王琴 

作者介绍:我国猪瘟参考实验室核心成员,致力于猪瘟防控技术研究,近年承担近十余项国家科技支撑及农业部有关猪瘟的专项科研项目,获资助约1,000万元。在猪瘟的流行病学、信息系统的建立、诊断系列新技术研发、疫苗效检替代方法、致病机制研究以及猪瘟的防控与净化技术方面取得了突破性进展。

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