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基于比较蛋白质组学研究新城疫病毒的入胞机制
  

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为验证新城疫病毒(NDV)入胞过程存在胞吞途径,本研究以感染了NDV的鸡胚成纤维细胞(CEF)为研究对象,采用比较蛋白质组学研究方法,双向凝胶电泳(2-DE)结合基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴定技术(MALDI-TOF-MS)分析3 株NDV 感染CEF 后24 h 和48 h 两个时间点细胞蛋白表达动态。试验结果显示早期内体标志蛋白早期内体抗原1(EEA1)表达水平变化显著,这表明NDV 可通过胞吞途径进入细胞;与其它两株病毒相比,胞吞作用在JS-5-05-Go 进入细胞的过程中,可以发挥更长时的效应。

病毒入胞机制是研究病毒与宿主细胞相互作用的重要环节,不断深入的研究不仅能更好地理解、认识病毒的致病性,还有助于抗病毒新药的开发和疫苗的研制。典型的病毒入胞过程包括与宿主细胞受体结合、穿膜和细胞内运输等过程,其中穿膜过程主要有融合(副黏病毒)、胞吞和直接进入(某些无囊膜病毒)3种方式,多数病毒家族利用胞吞作为入侵宿主细胞的途径。早期内体抗原1(Early endosome antigen 1,EEA1)是膜包裹的细胞质囊泡内体的标志,位于早期内体胞质面的亲水性外在膜蛋白,在胞吞作用中,卷曲螺旋结构在促进内体囊泡融合过程中发挥重要作用,N和C端锌指样结合域与Rab5-GTP 和磷脂酰肌醇-3-磷酸盐(PI3P)相互作用,从而促进膜融合。

新城疫(ND)是由新城疫病毒(NDV)引起的对世界养禽业危害极为严重的一种急性、高度传染性疾病。虽然关于NDV 各编码蛋白的分子生物学功能有了一定程度的了解,但是,目前对于NDV 与细胞相互作用机制尚不清楚,而这方面的研究对于了解病毒的致病机理至关重要。前期研究表明,NDV 是通过膜融合方式进入细胞,而Cantín 等通过抗NDV 单克隆抗体和抗早期内体标记EEA1 抗体双标免疫检测试验揭示了该病毒在这些细胞内的定位,从而推测NDV 进入细胞存在胞吞途径。病毒致病机理研究通常从病毒和宿主相互作用关系进行深入研究,采用比较蛋白质组学方法研究病毒感染细胞后差异表达的蛋白,有助于揭示病毒致病机制。

1、材料和方法

1.1 细胞和病毒

SPF 种蛋购自山东省家禽研究所实验种鸡场,由实验室自行孵化至10 日龄后按常规方法大批量制备原代CEF。基因Ⅲ型鸡源NDV 分离株JS-7-05-Ch、Ⅵ型鸽源NDV分离株WX-10-07-Pi和Ⅶ型鹅源NDV 分离株JS-5-05-Go,3 株NDV的pfu 分别为(1.28~1.6)× 108、(2.67~5.0)× 107 和(1.02~1.34)×109,均由扬州大学农业部畜禽传染病学重点实验室鉴定、纯化和保存。

1.2 主要试剂和仪器

尿素、硫脲、四甲基乙二胺、碘乙酰胺、CHAPS、Bio-Lyte pH3-10、蛋白定量试剂盒和IPG 预制胶条均购自Bio-Rad 公司,二硫苏糖醇(DTT)、蛋白酶抑制剂鸡尾酒混合液、考马斯亮蓝G-250、溴酚蓝、DNaseⅠ和RNase A 均购自Sigma 公司,等电聚焦仪和大通量灌胶器购自Bio-Rad 公司,扫描仪购自台湾Umax 公司,超声波破碎仪购自日本SANYO 公司,转瓶培养机In?tegra Biosciences Cellroll购自美国BiNDER。

1.3 CEF蛋白样品的制备

将CEF 铺种于细胞转瓶中,在长满密度为约85%时,分别接种10 MOI NDV,同时设立阴性对照组,接种病毒24 h 和48 h 时,收获细胞团块,采用细胞裂解液(按照1∶10(w/v)比例加入裂解液(尿素7 mol/L,硫脲2 mol/L,CHAPS 4%,DTT65 mmol/L,Bio-Lyte pH 3~10 0.2%和适量蛋白酶抑制剂鸡尾酒混合液;冰浴1.5 h 后向裂解液中加入终浓度为20 U/mL DNaseⅠ和0.25 mg/mL RNase A)结合超声波裂解处理的方法对CEF 进行总蛋白提取,运用96 孔微量酶标板Bradford 方法测定样品浓度。

1.4 CEF双向凝胶电泳

采用17 cm pH 4~7 线性IPG 胶条,分别取1.0 mg 的不同样品的细胞总蛋白加入水化液(尿素8 mol/L,CHAPS 4% ,0.001% 溴酚蓝,DTT65 mmol/L,Bio-Lyte pH 3~10 0.2%)中至终体积350 μL,按优化好的等电聚焦参数进行胶条主动水化和等电聚焦;先用平衡缓冲液Ⅰ(Urea6 mol/L,Tris-HCL 0.375 mmol/L pH 8.8,Glyc?erol 20%,SDS 2%,2%DTT)平衡14 min,然后转入到平衡缓冲液Ⅱ(尿素6 mol/L,Tris-HCL0.375 mmol/L pH 8.8,Glycerol 20%,SDS 2%,碘乙酰胺2.5%)中平衡14 min;在12%的SDS-PAGE凝胶上进行第二向电泳;采用胶体考染方法进行染色。脱色后的凝胶经扫描仪透射扫描,获得的凝胶图谱运用PDQuest8.0.1 进行图像分析,量的差异显著性分析采用Student′s-Test 检验法进行统计学分析。只有3 个样本中均重复出现的差异点才可被鉴定是差异表达蛋白。

1.5 质谱鉴定

用剪掉尖端200 μL Eppendorf 吸头从凝胶上戳取蛋白质点,再转入1.5 mL Eppendorf 离心管中,用超纯水洗涤3~4 次。由广州慧晶生物科技有限公司进行鉴定,采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴定技术(MALDI-TOF-MS)。

2、结果

2.1 CEF蛋白样品的制备

采用细胞裂解液结合超声波裂解方法制备的蛋白浓度范围基本保持在4.0~5.5 mg/mL范围内,提取的蛋白浓度稳定,表明蛋白制备方法可靠。

2.2 CEF蛋白双向电泳图谱

运用PDQuest8.0.1 检测到850 左右个蛋白点(见图1),批内蛋白点在重复样品的匹配率能达到90%以上,表明凝胶图谱的分辨率高、重复性好。

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2.3 PDQuest8.0.1 分析EEA1 的表达动态及质谱鉴定结果

质谱图中标示的蛋白点鉴定为EEA1,其质谱图见图2。3 株NDV 感染CEF 后24 h 时,EEA1 均上调表达,在感染后48 h 时,仅在JS-5-05-Go 感染组中被诱导表达(见表1、图3)。

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3、讨论

大家所熟知的NDV 入胞过程是通过膜的融合方式,NDV 最初通过HN 多肽与细胞表面的受体结合,从而引起HN 和F 蛋白的构象改变,经过F 蛋白的作用,病毒囊膜与细胞囊膜发生融合,紧接着M 蛋白和NP 蛋白分离,释放,核衣壳到细胞浆内,然后基因组RNA 开始转录和复制,NDV 各组分在细胞内合成后,通过出芽方式释放出成熟、有囊膜的病毒粒子。诸多研究表明,大多数的病毒首先进入早期蛋白酶体。内体是膜包裹的细胞质囊泡、邻近胞膜的独特细胞质斑点,参与细胞内外多种物质和大分子的转运,其标志为EEA1。EEA1 分布在细胞早内体、膜片段、外部质膜、胞浆以及核上,参与膜泡融合、突触膜泡内体融合以及早内体晚内体运输。Cantín 等通过抗NDV 单克隆抗体和抗早期内体标记EEA1 抗体双标免疫检测试验揭示了该NDV 在这些细胞内定位,从而推测NDV 进入细胞还存在胞吞途径,同时表明,这个通路可能是病毒进入细胞的替代路线。胞吞既可以介导病毒内化,也可以将病毒运输到复制位点。随着对胞吞过程中各组分结构和功能了解的日趋深入,研究胞吞过程以及病毒入侵过程的手段也变得更有效,特异性更高。

采用比较蛋白质组学方法研究病毒感染细胞后差异表达的蛋白,不仅能为阐明生命活动规律提供物质基础,也能为探讨重大动物疾病的机理、诊断、防治和新药开发等提供重要的理论依据和实际解决途径。在本研究,3 株病毒感染CEF 后24 h 时,EEA1 均发生不同程度上调表达,且WX-10-07-Pi 上调表达最明显,JS-5-05-Go 和JS-7-05-Ch 感染组中表达量相当;然而,在感染后48 h 时,仅在JS-5-05-Go 感染组中被诱导表达,且在两个时间点EEA1 的表达量相当。这表明EEA1 表达水平的变化与JS-5-05-Go 本身感染特性有关。NDV 除通过膜融合进入细胞外,还可以通过胞吞途径进入细胞。与其它两株病毒相比,胞吞作用在JS-5-05-Go 进入细胞的过程中,可以发挥更长时间的效应。

相信随着对NDV 入胞机制认识的不断深入,将会有更多的病毒入胞抑制药物被开发出来,从而能够更好地控制ND。

专家介绍
刘秀梵 

作者介绍:动物传染病学专家。出生于江苏省靖江市。1965年毕业于苏北农学院,中国工程院院士,中国畜牧兽医学会理事,动物传染病学分会副理事长。现任扬州大学兽医学院教授、博士生导师,国家重点学科预防兽医学学科带头人,农业部畜禽传染病重点开放实验室主任。

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