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猪病毒性腹泻的诊断和检测技术研究
  

猪病毒性腹泻类疾病是猪场常见疾病,目前已成为危害养猪业最大的一类疾病之一。腹泻一般有明显的季节性,尤其在秋冬、冬春换季,天气骤变时易发且流行速度快。主要通过消化道及呼吸道进行感染,随后诱发全群猪腹泻。几种病原混合感染比较常见,各年龄段的猪均可发病,发病后的死亡率与年龄密切相关,日龄越小,病程越短,死亡率越高,其对我国的养殖业造成了巨大的经济损失,严重影响经济效益。本文介绍该类疾病的可能病因、鉴别诊断方法和分子生物学检测技术。

猪病毒性腹泻的病原目前主要有猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪丁型冠状病毒(PDCoV)、猪轮状病毒(RV)、猪博卡病毒(PBoV)等,均可导致猪发病,以呕吐、腹泻、脱水为主要特征,仔猪的发病率和死亡率可高达 50% ~ 100%。另外猪的伪狂犬病毒(Pseudorabies,PRV)、圆环病毒、大肠杆菌和温和型 猪 瘟 病 毒(classical swine fever,CSFV)也可以引起仔猪腹泻,这需要我们逐一细致地分析病因,通过流行病学、临床诊断和实验室检测进行综合诊断。

1、病毒性腹泻的临床诊断

从临床诊断上看,PEDV、TGEV、PDCov、RV、PBoV 的症状比较相似,难以区分。但是 PRV 和 CSFV 与另外几种病毒性腹泻存在一定的区别。

1.1 PEDV、TGEV、PDCov

这 3 种疾病的病原都属于冠状病毒科,病毒特性、病猪发病特点、临床症状和病理变化非常相似 :1 至 3 日龄发病,一周内病死或淘汰率可达到 100%。乳猪和小猪严重腹泻、水样拉稀,部分猪有呕吐,吃奶后发病更严重。部分中大猪和母猪呕吐和腹泻,但死亡率不高。病变一般只集中在胃肠道,胃肠黏膜薄、充血,肠系膜淋巴结充血。PDCov引发的病例不多,但是在国外和国内都有单纯由该病毒引起的腹泻大暴发的病例报道。

1.2 猪伪狂犬病

感染伪狂犬病毒的发病猪会整窝发病和死亡,表现为突然发病,体温上升达 41 ℃以上,精神极度委顿,发抖,运动不协调,痉挛,呕吐,腹泻。表现出明显的神经症状、昏睡、呜叫、呕吐、腹泻,一旦发病,1 ~ 2 d 内死亡。剖检主要症状是肾脏布满针尖样出血点,其他肉眼病变不明显。中枢神经系统症状明显时,脑膜明显充血,脑脊髓液量过多,肝、脾等实质脏器常可见灰白色坏死病灶,肺充血、水肿和坏死点。

1.3 温和型猪瘟

感染温和型猪瘟病毒的仔猪会先后出现以下症状 :体温升高达 41 ℃,仔猪常伴有厌食、腹泻,眼结膜潮红发炎,皮肤发炎,共济失调,甚至后躯麻痹,粪便由褐色变黄色,后期肛门失禁,粪便沿着后腿淌下,恶臭异常。病猪迅速消瘦,腹下部及耳根皮肤呈紫红色淤血。病猪体温保持在 40 ℃左右,症状时轻时重,食欲时好时坏,粪便时干时稀。病程长者皮肤出现淤血斑和坏死块,以腹下部为常见。有时也出现紫耳朵、干尾巴、紫斑蹄。病猪的皮肤一旦破损或扎针后,局部淌血不止,血液凝固不良,也是该病的特征之一。

温和型猪瘟的病理变化主要特征性病变是胃黏膜大面积脱落、充血,肾脏不肿大,呈土黄色,可见大小不等的出血点,以针尖大小居多,脾脏肿大,色暗,表面散在有米粒大小的紫红色突起,质地较软,边缘有坏死灶,个别呈点状出血,淋巴结肿胀、水肿或出血、重者出现化脓、坏死、溃疡等病变,血液稀薄如水,流在地面上很少凝固,其他脏器病理变化不大。部分猪出现咽峡、软腭处和扁桃腺有白色坏死点、出血或溃疡,大肠回盲瓣可见钮扣状溃疡。胆肿大,其边缘出血,呈暗红色。

2、病毒性腹泻的生物学检测技术

猪被PEDV、TGEV、PDCoV、PoRV、PBoV感染后,都会出现呕吐和水样腹泻,致使发病猪脱水、生长不良、体重减轻,死淘率高达 90% 以上。剖检病变主要在小肠,可以发现肠壁变薄并且呈半透明状,弹性不足,黏膜充血,肠管内含大量液体,肠系膜淋巴结有水肿、充血等病变。胃内充满着白黄色的固体乳状物,胃黏膜充血。排出的稀粪中会含有没有完全消化的白黄色凝乳块,具有腥臭气味。

临床上很难鉴别这几种病毒病,所以鉴定需要进行实验室相关的分子生物学技术进行鉴别诊断,通常有以下几种检测方法 :

2.1 RT-PCR

PCR 技术以其快速、敏感、易于操作等优点在近年来被广泛应用。根据 Genbank 中选定病毒的一个基因保守区域基因序列设计引物,合成特异引物,然后从感染病毒的粪便或肠道组织中提取总 RNA,以此总 RNA 为模板,用下游特异引物将 RNA 反转录为cDNA,然后在 2 个特异引物存在的情况下用 Taq DNA 聚合酶进行扩增,合成特异的双链 DNA 目的片段。对扩增的 DNA 片段用琼脂糖凝胶电泳进行检测,然后进行测序分析,从而对患病动物进行确诊。PCR 能同时检测大批量的样品,并且能进行活体检测,适合于临诊诊断。

2.2 实时荧光定量 PCR 方法

实时荧光定量 PCR 方法是在 PCR技术基础上发展起来的一种高度灵敏的核酸定量技术,融汇了传统技术灵敏、快速、特异的特点及光谱技术高敏感性和高精确定量的优点,具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点。根据病毒设计特异性引物和 Taqman 探针,采取含病毒多的发病猪的器官组织部位,建立Taqman 实时定量 RT-PCR 检测病毒的方法。不仅适合病毒的临床样品的早期检测,也适用于疫苗生产过程中的质量控制及疫苗制品的效价评估。

2.3 酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验(ELISA)诊断方法具有敏感性和特异性强、操作简单、检测快速、高通量、无辐射、价格低廉等特点,是当前动物传染病检疫、流行病学调查等广泛采用的免疫学诊断技术,可用于规模化猪场大批样品的抗体检测。抗原 :应用推荐的毒株的病毒或相应蛋白制备。用于制备抗原的细胞应没有任何其他腹泻病毒感染。抗血清 :用于竞争或阻断试验的多克隆抗血清可通过试验推荐的毒株来制备,单克隆抗体则可采用相应的病毒免疫显性蛋白直接法制备。间接法采用的抗猪免疫球蛋白试剂应能检测到猪 IgG 和 IgM。根据 ELISA 的基本原理,发展出了间接ELISA、Dot- ELISA、微波快速 ELISA、竞争 ELISA 以及抗原捕获 ELISA。

2.4 免疫荧光法

采取病猪的肠道或其他组织,做成冷冻切片,进行直接免疫荧光法检测抗原。这个方法是活体诊断,可以迅速做出判断。或者利用已研制的抗病毒蛋白的单克隆抗体,采用间接免疫荧光试验对接种病毒的细胞培养物进行了病原检测,并与全病毒制备的抗血清进行比较,以评价抗病毒蛋白单克隆抗体快速检测的潜在应用价值。

2.5 免疫电镜法

这几种腹泻冠状病毒,形状非常相似,在普通电镜下无法区别,为此需用免疫电镜法 (IEM)。同时免疫电镜在进行临床样品或细胞培养样品中病毒的血清学鉴定上显示出了更大的优势。利用A 蛋白和抗病毒的特异性血清包被电镜网格而制作的固相免疫电镜检查法,能提高检测的灵敏度,其效力至少提高100 倍。此方法不单可用于发病时的诊断,也可以用于发病的潜伏期诊断。

2.6 环介导等温核酸扩增技术

环介导等温核酸扩增技术(LAMP)是一种新型的核酸扩增技术,依赖 4 条特异设计的引物和一条具有链置换特性的 DNA 聚合酶,在等温条件保温几十分钟,即可完成核酸扩增反应。不需要模板的热变性、长时间温度循环、繁琐的电泳、紫外观察等过程。近年来该法被广泛应用于病原体的检测。LAMP 检测试剂盒不需要先进的仪器,并且具有特异性强、敏感度高、检测周期短、操作简便以及易于推广等优点。不过LAMP 也有缺点,就是因为灵敏度高,一旦开盖容易形成气溶胶污染,加上目前国内大多数实验室不能严格分区,因此需要避免假阳性的问题。

3、总结

虽然当前出现腹泻症状的疾病种类相对较多,但在全国范围内,以流行性腹泻(PED)为主的病毒性腹泻危害最为严重,且自 2010 年以来疫情持续不断。各种病毒性腹泻病的临床症状和解剖病变十分相似,给临床快速诊断带来不少困难。为了及时对症防控和治疗,减少经济损失,需要及时正确采取病料送至实验室做相关的实验室确诊。同时,在日常的猪场管理中,注意生物安全防控,控制产房的温度和湿度,做好产房的全进全出措施,并注重消毒空栏,切断一切可能的传染源,才能更好地控制该病。免疫防控时一定要选用高质量的腹泻疫苗,最好选用高抗原含量的变异株 PED+TGE 疫苗。

专家介绍
贺东生 

作者介绍:贺东生博士、华南农大教授、博士生导师。现任国家农业部兽药疫苗评审委员会委员、广东省生猪产业体系猪病岗位科学家。美国康州大学访问教授、弗吉尼亚大学博士后、华南动物疫病检测中心主任,动物防疫学会和养猪协会专家委员。中国著名猪病实战专家、疫苗研发和猪病防控科学家,专长猪病综合诊断、生产防控、疫苗研发和应用。历任多家著名疫苗厂、集团猪场顾问,成功防控疫病数千例。有7 项疫苗产品成功出让给江苏四川和广东的著名疫苗企业。

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