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一株类禽 H1N1 亚型猪流感病毒的进化研究
  

为了解猪流感病毒( SIV) 的变异情况,2013 年 1 月份从山西某养殖场采集呈流感症状的猪鼻拭子 10 份,采用常规方法接种10 日龄 SPF 鸡胚,进行 RT - PCR 鉴定及全基因序列分析。结果表明:分离到1 株类禽 H1N1 亚型猪流感病毒,命名为 A/swine/Shanxi/02/2013( H1N1) ; 全基因序列测定及同源性分析发现,8 个基因片段均与 2011 年江苏地区流行的类禽型 H1N1 亚型猪流感病毒有较高的同源性; 系统遗传演化发现,该病毒株是由 2011 年类禽型 H1N1 流感病毒 A/swine/Jiangsu/40/2011( H1N1) 进化而来的; HA1 氨基酸位点差异分析发现,该病毒株与 2009 年人群中流行的甲型 H1N1流感和经典 H1N1 毒株抗原性差异较大,其 HA 裂解位点基序为 PSIQSRGLF,呈低致病性特征。

猪流感病毒(Swine influenza virus,SIV)属于正黏病毒科 A 型流感病毒属,为单股负链分节段 RNA病毒,其基因组由 8 个独立节段构成,大小约为13.6 kb。猪流感表现为急性、高度接触性、传染性的呼吸道疾病症状,SIV 不但威胁世界各国养猪业,还严重威胁人类,有重要的公共卫生意义。

目前,在猪群中流行的 SIV 主要有 H1N1、H3N2和 H1N2 三种亚型。H1N1 亚型 SIV 主要包括经典和禽源 H1N1 亚型 SIV,在我国南部分离到 20 世纪 90年代早期在猪群中共同流行的类禽型 H1N1 病毒和经典 H1N1 病毒。流感病毒具有严格的宿主特异性,一般病毒很少跨越种间屏障在另外的宿主群内建立稳定的谱系。猪的呼吸道上皮细胞存在唾液酸 ɑ2,6受体和 ɑ2,3 受体,因此猪被认为是禽流感病毒(AIV)对人适应过程的中间宿主或作为遗传学上重配病毒的混合器。具有跨种间传播能力的病毒特性一直是流感病毒研究中的热点。本研究对分离的 1 株禽源 SIV 进行遗传演化、抗原性分析,以期进一步阐明猪流感的流行病学,为猪流感的防治提供病原学相关的理论基础。

1、材料

2013 年从山西某猪场采集疑似流感症状猪的鼻拭子 10 份,采用常规方法接种 10 日龄 SPF 鸡胚,72小时时收获尿囊液,用 0.75 % 鸡红细胞鉴定其血凝性,有血凝性的尿囊液用 PBS 稀释为 1 ×    10 -3   ~1 ×  10-6   后再接种 10 日龄 SPF 鸡胚进行病毒增殖。试验所用鸡胚均购自新兴大华农禽蛋有限公司。

2、方法

2.1 病毒亚型的鉴定

利用 RNA 纯化试剂盒[购自宝生物工程(大连)有限公司]提取病毒 RNA,并以 Unin -12 为引物,按照反转录酶 AMV 试剂盒(购自 Invitrogen 公司) 说明书反转录合成 cDNA。用特异性亚型鉴定引物(由华南动物疫病检测中心设计,上海生工生物工程技术服务有限公司合成)通过 PCR 扩增鉴定病毒亚型。

2.2 全基因序列测定与分析

2.2.1 全基因序列测定 取待检病毒尿囊液样品250 μL,以反转录合成的 cDNA 为模板,采用 SIVH1N1 亚型各节段特异性 PCR 引物(由华南动物疫病检测中心保存)扩增 8 个基因片段,胶回收 PCR 产物,连接转化后送上海生工生物工程技术有限公司测序。

2.2.2 病毒分子特征与遗传演化分析 利用 DNAS-tar 软件中的 Seqman 程序拼接所有序列,应用 NCBI检索同源性,采用 MEGA 5.0 软件进行分析并绘制进化树,同时对 HA1、NA、M 和 PB2 氨基酸序列进行流感病毒分子特征分析。

3、结果

3.1 病毒分离鉴定

经血凝试验和特异性 PCR 鉴定,分离得到 1 株H1N1 亚型流感病毒,进行全序列测定和生物学特性分析,将其命名为 A/swine/Shanxi/02/2013(H1N1),简称 SW/SX/02/13。

3.2 核苷酸同源性

通过 GenBank 中 BLAST 程序对该病毒的全基因序列比较发现,其中 PB2、PA、HA 和 M 4 个节段与A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1) 同源性最高,PB1基因和 A/swine/Jiangsu/zg15/2011(H1N1)同源性最高,NP 基因和 NA 基因与 A/swine/Jiangsu/zg7/2010(H1N1) 同源性最高,NS 基因和 A/swine/Jiangsu/zg17/2011(H1N1) 同源性最高,具体结果见表 1。3 个相关毒株均为2010—2011 年江苏地区流行的类禽型 H1N1 亚型 SIV。

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3.3 病毒序列分子特征分析

全基因测序结果表明:SW/SX/02/13 的 HA 基因编码区由 1 701 个核苷酸组成,编码 566 个氨基酸;NA 基因编码区由 1 413 个核苷酸组成,编码 470个氨基酸。根据血凝素蛋白氨基酸序列和分子构象可推测:HA 蛋白除前 17 个氨基酸为信号肽外,其余分为 HA1 (326 aa)和 HA2 (222 aa)2 个亚基,二者通过 1 个碱性氨基酸 R 连接,裂解位点的氨基酸序列为 PSIQSR↓G,只含 1 个碱性氨基酸,不具有高致病性流感病毒特征。在 HA1 结构域中,H1N1 流感病毒的受体结合位点(RBS) 由 2 个环和 1 个螺旋组成。与经典型和 2009 年流行的甲型 H1N1 SIV 的HA 氨基酸序列比较,SW/SX/02/13 在 HA1 上的 4个抗原表位(Cb、Sa、Sb、Ca)高度易变,每个抗原位点都有多个氨基酸的差异(见表2),HA2 的抗原表位相对保守。

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表面蛋白的糖基化位点对流感病毒的外在抗原特性和受体结合特性具有很大影响,糖基化位点数目的不同、位置的不同均可能影响蛋白质的折叠、聚集和转移。SW/SX/02/13 的 HA 肽链上有 8个潜在糖基化位点,其中 6 个分别位于 HA1 区氨基酸的 27,28,40,71,212,291 位,2 个位于 HA2 区氨基酸的497 ,556 位。SW/SX/02/13 主要的4 个抗原表位及潜在糖基化位点与参考毒株 A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)一致。NA 蛋白糖基化位点的增加可能不仅降低了流感病毒与宿主受体的亲和力,而且减少了病毒颗粒的释放。在本研究中,SW/SX/02/13 毒株与各参考毒株中的 NA 蛋白均具有 7 个糖基化位点,其中 4 个(N 44 、N 58 、N 63 和 N 68 )在 NA 链接区,3 个(N 88 、N 146 和 N 235 )在 NA 结构域。PB2 - 701位置的 Asn 替换为 Asp,将会降低病毒对小鼠的致病性,反之将会增强病毒对小鼠的致病性。研究发现,SW/SX/02/13 毒株和类禽型参考毒株在该位点为 Asn,这可能表明类禽型 SIV 是因为该位点的存在而有利于其在猪体内的长期存在。离子通道 M2 蛋白上的 30 位(A)和 31 位(S)氨基酸变异会导致病毒对金刚烷胺类药物产生耐药性,经序列比对,SW/ SX/02/13 毒株未发生这 2 种基因突变,预示该毒株对金刚烷胺类药物敏感。

3.4 病毒 HA 基因和 NA 基因核苷酸系统进化分析

通过 HA 基因的系统进化分析可以将猪和人的H1N1 病毒分为 3 个亚群,包括经典 H1N1、类禽H1N1 和 2009 年流行的甲型 H1N1 流感病毒。序列分析结果显示:SW/SX/02/13 的 8 个基因均位于类禽型亚群当中,没有发生重组,并与 2011 年江苏地区流行的流感毒株 A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)进化关系最近,见图 1,对于流感病毒另外一个表面基因———NA 基因的进化分析也显示了类似特征,见图 2。

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4、讨论

猪的呼吸道上皮细胞同时拥有唾液酸 α2,6 受体和 α2,3 受体,因此猪被认为是禽流感病毒跨种间传播到人的中间宿主或是作为遗传学上重配病毒的混合器。1957 年和 1968 年爆发的人流感大流行均是由重配病毒引起的,后者含有来源于禽流感和人流感病毒的内部基因节段。1998 年,1 株禽和人流感病毒的重组体在美国猪群中引起了流感的大爆发;2009 年3 月份起源于墨西哥的甲型 H1N1 流感病毒,造成了巨大的经济和生命损失,其流行株病毒基因片段由禽源、人源及猪源流感病毒基因重组而成。在中国,最近几年相继报道了人流感、禽流感和猪流感的重组体,这是由于多基因型 SIV 在猪群中共存,提供了更多的病毒重组机会。由于人群和猪群缺少相应的抗体,这些重组病毒往往造成巨大的危害。

华南动物疫病检测中心从山西某养殖场采集的猪鼻拭子中分离得到 1 株 SIV,经同源性比对和遗传演化分析,确认其为类禽型 H1N1 亚型 SIV。尽管经典 H1N1 亚型 SIV 在美国、日本、新加坡、中国等地存在,然而在欧洲禽源 H1N1 流感病毒正逐渐取代经典型 SIV 而成为主要的流行毒株。1979 年,在欧洲猪群中发现了一种与经典 H1N1 亚型 SIV 的抗原性和遗传性都不同的禽源 H1N1 亚型 SIV,该毒株与分离于鸭体的 H1N1 流感病毒的亲缘关系密切,由H1N1 亚型禽流感病毒跨种属传播至猪群引起。禽源 H1N1 对经典 H1N1 亚型 SIV 的替代,意味着该禽源 H1N1 亚型 SIV 比经典 H1N1 亚型 SIV 有明显的选择优势。1993 年,中国 H1N1 亚型禽流感病毒从禽传播至猪群中,与经典 H1N1 亚型 SIV 共同流行于当地,形成了欧亚类禽型 SIV 的一个亚洲分支。该病毒可能会通过在猪体内的适应,再传播给人类造成在人群中的大流行,2011 年在我国江苏地区发生一起类禽型 H1N1 亚型 SIV 感染儿童事件,在当地猪场的猪体中分离到与该毒株同源性极高的 SIV 毒株 A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)。本研究中的 SW/SX/02/13 毒株与江苏地区的 A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1) 毒株亲缘关系最近,该种亚群的 SIV 是否会在猪群中大流行,进而威胁人类的健康还有待进一步研究。

专家介绍
贺东生 

作者介绍:贺东生博士、华南农大教授、博士生导师。现任国家农业部兽药疫苗评审委员会委员、广东省生猪产业体系猪病岗位科学家。美国康州大学访问教授、弗吉尼亚大学博士后、华南动物疫病检测中心主任,动物防疫学会和养猪协会专家委员。中国著名猪病实战专家、疫苗研发和猪病防控科学家,专长猪病综合诊断、生产防控、疫苗研发和应用。历任多家著名疫苗厂、集团猪场顾问,成功防控疫病数千例。有7 项疫苗产品成功出让给江苏四川和广东的著名疫苗企业。

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