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检测沙门菌活菌数的 MTT 方法建立
  

本研究旨在探讨 MTT 法用于沙门菌 (Salmonella) 活菌计数的可行性及操作的最佳试验条件。通过改变波长、反应时间、试剂剂量等,确定 MTT 法测沙门菌活菌数的最佳试验条件,同时采用 Pearson 相关模型进行双变量的相关性分析。结果显示 MTT 检测沙门菌活菌数与平板计数法的测量结果是一致的,并且不同生长阶段的沙门菌对检测结果没有影响。研究表明 MTT 法用于检测沙门菌活菌数是可行的。

作为一个热门研究目标,沙门菌因其在公共卫生、医疗诊断、药物研究及发病机制的重大价值引起科学界的广泛关注。尽管许多国家在食品生产过程中实施了各种措施控制沙门菌,沙门菌依然是全球最常见的人畜共患食源性疾病的一个主要原因。据报道,在欧盟 (EU),沙门菌是引起食源性疾病的首要原因,截止至 2010 年,在过去几年中肠炎沙门菌与鼠伤寒沙门菌是从人类身上分离到的最常见的两个血清型 (分离率分别为 46. 6%和 6. 9%)。其感染的主要来源是动物性食物,如蛋和蛋制品,而在蔬菜感染来源的报道也在增加 。

大约30 年前 MTT 法首次被 Mosmann 提出,具有简单、经济、快速等特点,被广泛用于细胞活性检测、肿瘤细胞药敏检测、抗肿瘤药物大规模筛选、细胞毒性试验等方面。MTT 是一种噻唑盐,全称为 3- (4,5-dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide。汉语化学名为 3- (4,5-二甲基噻唑 -2) -2,5- 二苯基四氮唑溴盐,水溶液为黄绿色,是一种接受氢离子的染料。近年来,也有 MTT 法在细菌方面的应用的报道,例如龚加路等将 MTT 法应用于酵母菌的活菌计数; 袁琳等应用 MTT 法检测金黄色萄萄球菌活菌数; 杨培洁应用 MTT 法测定瑞士乳杆菌 MB 2-1 活菌数。而MTT 法用于沙门菌尚未见报道。在科研生产工作中,需要广泛应用活菌计数方法。到目前为止,已经提出超过 50 种化学、物理、微生物方法用于检测细菌和总活 菌 计 数,例 如 平 板 稀 释 法、光 密 度(OD) 值 法、菌 体 干 重 法、血 细 胞 计 数 板法、最大或然数 (most probable number,MPN)法等,而这些活菌计数方法大部分是需要耗费大量时间,且大部分不能区分细胞是否存活。因此,需要有一种快速的分析方法或工具,以便对沙门菌的进行更深入的研究。因此,本文在参考相关研究的基础上,针对 MTT 法,系统的研究其各种影响因素对测定沙门菌活菌计数的影响,探究用 MTT 法快速准确测定沙门菌活菌数的方法。

1、材料与方法

1. 1 材料

1. 1. 1 菌种

肠炎沙门菌 ATCC13076 菌株由福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心提供。

1. 1. 2 试剂

MTT (Amreso 分装)、二甲亚砜 (DMSO) (Sig-ma)、PBS (Solarbio)。

MTT 溶液配制: 称取 100 mg MTT (Amreso 分装) 于血清瓶中。加 20 mL PBS (0. 01 mol/pH7. 2),使其充分溶解,用 0. 22 μm 微孔过滤器除菌,分装于 10 mL 的 EP 管 -20 ℃避光保存。

培养基: 脑心浸液肉汤 (BHI) (广东环凯生物科技有限公司)

1. 2 方法

1. 2. 1 沙门菌培养

复活冻存菌,培养 24 h 至稳定期,取 1mL 接种于100 mL BHI 肉汤中,37 ℃、190 r/mi-1  条件下培养 15~18 h,即达到对数生长后期,以进行下一步试验。

1. 2. 2 MTT 比色法测定沙门菌活菌数的试验条件

确定最大吸收峰的确定: 取培养好的菌液用无菌生理盐水按 1 : 2、1 : 4 比例稀释,取原菌液、1/2、1/4稀释菌液,加入无菌 96 孔平底板中,每孔加入菌液100μL、MTT 20 μL,置于 37 ℃恒温培养箱中培养 1h,分别做弃去上清液与不弃去上清液两个对照,弃去上清液组在培养 1 h 后离心 10 min,两组均加入100 μL 二甲基亚砜 (DMSO), 120 r/min-1  震荡 10min,在 400~700 nm 波长范围内间隔 5 nm 测定光密度值 (OD),测定 OD 达最大值时波长,即为最适波长,以 100 μL 生理盐水 +20 μL MTT+100 μL DMSO作为空白对照。每个浓度做 6 个平行对照。

DMSO 用量的确定: 取培养好的菌液 100 μL 于96 孔细胞培养板中,同时做好空白对照,加入 20 μLMTT,混匀后置于 37℃恒温培养箱避光培养 1 h,分别做不弃去上清液加入 0 μL DMSO、100 μL DMSO、150 μL DMSO 及弃去上清液加入 100 μL DMSO、150μL DMSO 5 组对照,400~700 nm 波长范围内间隔 5nm 全波长扫描。

最适还原反应时间确定: 取培养好的菌液 100μL 于 96 孔细胞培养板中,同时做好空白对照,加入20 μL MTT,混匀后置于 37℃恒温培养箱分别避光培养 20 min、40 min、60 min、90 min、120 min,加入中最佳剂量的 DMSO,400~700 nm 波长范围内间隔 5nm 全波长扫描。

MTT 剂量确定: 取培养好的菌液 100 μL 于 96 孔细胞培养板中,同时取不接菌的 BHI 肉汤做空白对照,分别加入 MTT 溶液 5 μL、10 μL、15 μL、20μL、25 μL、30 μL,用快速混匀器混匀后置于 37 ℃恒温培养箱避光培养确定时间,加入中最佳剂量的DMSO,400~ 700 nm 波长范围内间隔 5 nm 全波长扫描。

干扰物的影响: 对试验过程中接触到的介质进行干扰因素排除试验,以 DMSO 为参比,将灭菌培养基、生理盐水、死菌体 (120 ℃高压灭菌 30 min) 作为干扰物,用 MTT 法分别测定吸光度,每个试验做6个重复。

测量范围的确定: 取培养好的菌液按 10 倍浓度稀释 9 个梯度,用以上步骤确定好的 MTT 法最佳条件测定各个稀释倍数菌液的 OD 值,分析 MTT 法测定沙门菌的活菌的可测定范围。

MTT 法与平板计数法的关系: 取培养好的菌液对半稀释,测原菌液、1:2、1:8、1:16、1 :32、1 :64、1:128、1 :256 各稀释菌液用 MTT 法分别测定吸光度,每个试验做 6 个平行,同时用平板计数法测定各稀释度下的菌落数,建立菌落数与 OD515 间的关系。

不同菌龄细菌对 MTT 法的影响: 将沙门菌分别培养 12 h (对数生长前期)、24 h (稳定生长期)、36 h (稳定生长末期) 后采用 MTT 法测量 OD,平板法测定活菌数,绘制细菌浓度与 OD 变化图,分析不同菌龄细菌活菌数与 OD 的关系。

2、结果与分析

2. 1 最大吸收峰的确定

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图 1 为原菌液、1 ∶ 2、1 ∶ 4 稀释菌液与 MTT 反应后的 400~700 nm 范围内每隔 5 nm 的波长扫描图。从图 1 可看出,弃去上清液组甲臜在 500~600 nm 范围内有较大的吸收峰,没有明显的特异性吸收峰,并且不同的菌液浓度对吸收峰影响不大,仅对 OD 值产生影响。不弃上清液组 400~450 nm 范围内有比较明显的特异性吸收峰,与弃去上清液组的吸收峰差别较大,分析可能原因试验中没有弃去上清液,甲臜处于BHI 肉汤、水、DMSO 以及可能没有反应完全的 MTT的混合体系中,各种液体相互干扰影响甲臜溶解,进而影响吸收峰,并且不弃去上清液组 3 种菌液浓度之间的 OD 值差异不大。

2. 2 DMSO 用量对吸收峰的影响

对比 3 种 DMSO 用量的条件,发现不加入 DMSO反应体系呈蓝绿色,加入 DMSO 后反应体系变成紫色,并且随着加入的 DMSO 量增加,反应体系的紫色变深,说明甲臜溶解更完全。而弃去上清液组与不弃去上清液组对比发现,不弃去上清液组在加入DMSO 量比较多时,在 500~600 nm 之间虽然有出现比较宽的吸收峰,但是相较于弃去上清液组,OD 值很小 (见图 2),说明混合液体对甲臜的吸收峰影响较大,因此,本试验在培养结束后先 3 000 r?min  -1  离心 10 min 弃去上清液,再加入 DMSO 震荡 10 min溶解后再进行检测。

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2. 3 不同反应时间对吸收峰的影响

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图 3 为 20 μL MTT 与 150 μL DMSO 在反应时间为 20、40、60、90、120 min 条件下的吸收峰特征,由图可以看出,在加入 20 μL MTT、150 μL DMSO 条件下,随着反应时间的延长,甲臜的吸收峰依旧在500~600 nm 之间有出现比较宽的吸收峰,没有发生变化,但是 OD 值有发生变化,随着反应时间增加,OD 值逐渐增大,并在反应时间为 120 min 时达到最大,但由于第 90 分钟以后吸光值增加不大,故选择90 min 为反应终点。

2. 4 MTT 使用剂量对吸光度的影响

当 MTT 含量较低时,反应不完全,甲臜未完全析出,也会影响试验结果,因此,本试验选择 5 μL~30 μL 范围进行试验,由图 4 可以看出,MTT 的加入的量并不影响吸收峰,甲臜的吸收峰依旧在 500~600 nm 之间有出现比较宽的吸收峰,没有发生变化,但是随着 MTT 剂量增加,OD 值逐渐增大,并在 MTT使用剂量为 25 μL 时达到最大值,在 30 μL 时,吸光值逐渐降低,故选择 MTT 使用剂量为 25 μL 为试验使用剂量。

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2. 5 干扰物对试验结果的影响

在试验过程中,细菌的状态、培养基,使用的各种试剂均可能对试验结果产生影响,以超纯水作为空白对照,用 MTT 法检测生理盐水 +DMSO、生理盐水+MTT、生理盐水 +MTT+DMSO、BHI 肉汤、死菌体(120℃高压 30 min) 在 400~700 nm 范围内各个波长下的吸光值,由图 5 可以看出,在甲臜的吸收峰处500~600 nm 处,各干扰物的吸光值均趋近于 0,基本可以忽略。由图 6 可以看出,死菌体对 MTT 法的干扰较大,但是从 460 nm 起,死菌体的吸光值基本变动不大,同时,由图 1 至图 3 也可看出,甲臜在690 nm 之后吸光值很小,因此,本试验取 690 nm 为参考波长,同时,对比图 1 至图 4 各组试验结果,可以看出,甲臜在 500~600 nm 之间虽然没有明显的特异性吸收峰,但是 OD 值在 515 nm 处达到最大值,因此,确定 515 nm 为 MTT 法检测沙门菌的最大吸收峰,用甲臜的最大吸收峰OD515 减去参考波长OD690 ,以此来降低死菌体的影响。

微信截图_20171124102036.png微信截图_20171124102048.png

2. 6 测定范围的确定

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取 1. 2. 1 培养好的菌液按 10 倍浓度稀释 9 个梯度,MTT 法测定其 OD515-690 值,测量结果如表 1 所示,对各浓度菌液的 OD515-690 值进行多重方差分析,仅菌液浓度为 109 、108 、107 cell/mL-1  组的数据间有显著性差异,其余 6 组数据间均无显著性差异,即当菌液浓度低于 10 6 cell/mL-1  时,对 OD 515-690 值变化影响不显著,因此,可以得出以下结论,MTT 法检测沙门菌活菌数的检测范围为 10 7 ~10 9 cell/mL-1  细菌。

2. 7 MTT 法与平板计数法的相关性

由 2. 1~2. 6 的试验结果可归纳出 MTT 检测沙门菌活菌数的具体操作方案为: 取待测沙门菌菌液 100μL 加入无菌96 孔板中,分别以空白 BHI 肉汤以及无菌水为空白对照,再加入 25 μL MTT (5 mg/mL),震荡混匀,置于 37℃ 恒温培养箱培养 90 min,再离心 10 min,弃去上清液,加入 150 μL DMSO 溶解甲臜,120 r/min 震荡 10 min,515 nm 波长检测,以690 nm 作为参考波长,测定 OD515-690 值。在此方案的基础上,本试验应用目前最为常用的也比较准确的活菌计数方法平板计数法验证 MTT 法用于沙门菌活菌计数的可行性。

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采用 SPSS 软件统计分析平板计数法菌液浓度 C与 MTT 法 OD515-690 值间的相关性。SPSS 相关性分析过程中,对于不同类型的样本变量,采用的计算公式不同。平板计数法菌液浓度 C 与 MTT 法 OD515-690 值均属于随机变量,故采用 Pearson 相关系数模型进行双变量的相关性分析,统计结果如表 2 所示,二者的相关系数为 0. 999,说明二者高度相关,显著性 P =0. 000<0. 01,差异极显著。同时采用 Excel 软件绘制二者的线性关系图,如图 7 所示。如图可见,在测量范围内,C 与 OD515-690 值呈正相关的线性关系 (P =0. 998) 表明 MTT 法适用于沙门菌的活菌计数,并且是快速准确的。

2. 8 不同菌龄细菌 MTT 法检测的差异

由于不同生长阶段沙门菌琥珀酸脱氢酶的量与活性可能会有所不同,,而甲臜的生成有取决于细菌的琥珀酸脱氢酶的量与活性,因此,需要分析不同生长分别取培养 12 h (对数生长前期)、24 h (稳定期)、36 h (衰亡期) 沙门菌,平板计数法测量其菌液浓度,再用 MTT 法检测其   OD  515-690  值,分析二者间的关系 (图 7)。

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由图 8 可以看出,不同生长阶段的沙门菌的菌液浓度与    OD  515-690    值呈线性关系,且直线基本重合,斜率相近 (见表 3),同时所做的 6 个重复中不同生长阶段的沙门菌菌落数与吸光值的线性关系斜率之间 P=0. 754>0. 05,组间差异无统计学意义 (见表 4)。试验结果表明,MTT 法适用于不同生长阶段的沙门菌活菌计数。

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3、讨论

对食品安全的管理和监测工作来说,食物是否具有危害性或有潜在危害因素是关注的焦点,因此对样本中是否携带活菌以及含有多少活菌量的检测更具有现实意义。例如,将活菌计数方法应用于畜禽肉类样品中进行定量检测,以获得我国肉类的细菌准确的定量检测数据,其一,可以为卫计委制定国家食品安全标准提供数据基础,其二,为农科委制定相关政策提供科学依据,进一步来说,活菌计数对国家开展食源性病原菌风险评估工作,对提高我国食源性致病菌监测和预警能力,对保障公共卫生安全具有重要意义。而在科研生产工作中,常常也需要建立在细菌计数基础上。在实际的样品检测中,由于死菌会较长时间的残留在环境中,因此,单一评估样品中的细菌数量可能会高估活菌的数量甚至出现假阳性的结果,因此就需要使用活菌计数方法。例如,对于细菌抑制剂的研究,在活菌计数的基础上,也会对其抑制效果有一个更充分的认识。对于抗生素使用、细菌耐药性的研究,在活菌计数基础上,也会对细菌耐药程度有一个更全面的了解。对于益生菌产品的质量评定,在活菌计数基础上,对于益生菌产品的质量也有一个直观的认识。

平板涂布法是目前用于活菌计数最为广泛的方法,此方法虽说的准确性比较高,但在处理大量样本时,需要很多的培养皿和培养基,操作过程繁琐,容易出错,且耗时较长,不能满足社会快速检测的需求。除此之外,目前也有报道应用 PMA RT-PCR 活菌计数法、EMA RT-PCR 活菌计数法来做活菌计数。与这些方法相比,MTT 法具有成本低,操作简便,用时少,试验条件易满足等优点,常被用于活细胞计数,当然,也有 MTT 法用于活菌计数的报道,但是由于细菌种属的不同、细菌大小不同、琥珀酸脱氢酶含量不同、细菌活性不同等原因,MTT法用于不同细菌的活菌计数的最适反应条件也不同。

本试验首先探讨了在不弃去上清液情况下,DMSO 对沙门菌中甲臜颗粒的溶解情况,结果表明,在不弃去上清液条件下,不同浓度的沙门菌吸光度无明显差异,不弃去上清液对检测结果影响极大,这与大部分已报道的 MTT 法用于细菌活菌计数不需要弃去上清液结果差异较大,可能是由于细菌种属不同造成的。MTT 法用于沙门菌活菌计数的最适波长为 515 nm,不同于已报道的动物活细胞检测所用的波长 490 nm  、570 nm,也不同于已报道的细菌检测波长,例如黄立坤等用 MTT 法测定乳酸菌活菌数用 570 nm、龚加路等用 MTT 法测定酵母菌的活菌数用 500 nm,这可能是细菌种类不同造成。

沙门菌活菌数测定的反应时间为 90 min,与动物细胞测定的 4 h,金黄色葡萄球菌测定的 2 h 不同,这可能是由于细菌大小不同,不同细菌琥珀酸脱氢酶含量不同所致。

在试验中,沙门菌活菌数测定 MTT 最适用量为25 μL,过多加入 MTT 第一是造成浪费,第二是过多MTT 毒性较大,可能对细菌造成损失,反而影响细菌活菌计数。同时为排除甲臜与 DMSO 反应不完全造成的干扰,在反应结束后,在 120 r/min 条件下震荡 10 min 处理后,再进行检测以排除干扰。

4、结论

①试验结果确定了 MTT 法测定沙门菌活菌数的最佳工作条件为: 菌液100 μL、MTT 25 μL、在37℃培养 90 min,离心 10 min,弃去上清液,再加入 150μL DMSO 溶解甲臜,120 r/min 震荡 10 min,515 nm波长检测,以 690 nm 作为参考波长。

②采 用 双 波 长 法 测 定 沙 门 菌 活 菌 数,即 用   OD   515-690  值反应沙门菌活菌数,不仅可以降低死菌的影响,同时也不会对甲臜的吸收峰产生影响。

③试验中对比了相同条件下弃去上清液与不弃去上清液的   OD  515-690  值,发现不弃去上清液对检测产生极大影响,OD    515-690 值变动很大,因此,为排除上清液的干扰,使结果更准确,试验采用离心弃去上清液,再加入 DMSO 溶解后再测 OD    515-690   值。

④当沙门菌菌液浓度在 1×10 7 ~10 9 cell?mL -1     时,采用 Pearson 相关系数模型进行相关性分析结果表明OD 515-690 值与菌液浓度二者高度相关,且呈现良好的正相关线性关系,R 2 大于 0. 99,满足此范围内沙门菌的活菌计数要求。

⑤试验结果表明,不同菌龄的沙门菌的活菌数与OD 515-690 值间的线性关系不发生变化,即 MTT 法适用于不同生长阶段的沙门菌的活菌计数要求。

专家介绍
俞道进 

作者介绍:俞道进博士,现任福建农林大学动物科学学院教授、硕士生导师、系主任。中国畜牧兽医学会药理与毒理学分会常务理事。2003年华南农业大学基础兽医学专业研究生毕业,获博士学位。

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