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大蒜素对副猪嗜血杆菌抑制作用机理的研究
  

副猪嗜血杆菌(H.parasuis)的广泛流行以及耐药性的产生给养猪业带来了巨大的经济损失,开发新型的治疗药物以及防治策略已经显得尤为必要。研究集中探讨群体感应抑制剂大蒜素对副猪嗜血杆菌(H.parasu-is)的抑菌效果及机理。研究发现,大蒜素对 H46 的最小抑菌浓度(MIC)范围在 16~32 μg/mL,对副猪嗜血杆菌的生长曲线有明显的抑制作用;同时能够显著抑制生物被膜的形成。定量 PCR 分析发现,经过 8 μg/mL 和16 μg/mL 大蒜素处理的副猪嗜血杆菌,溶血毒素基因 hhdA、mviN 以及抗生素外排泵基因 norM 表达下调。结果说明大蒜素对副猪嗜血杆菌有明显的抑制效果,并且可抑制溶血毒素、毒力因子以及抗生素外排泵等基因的表达,为大蒜素用于副猪嗜血杆菌的临床防控提供了理论基础。

副猪嗜血杆菌(H.parasuis)是巴氏杆菌科嗜血杆菌属的一种革兰氏阴性短小杆菌,其生长严格依赖V 因子,是定植于猪上呼吸道的条件致病菌。该菌能够躲避宿主的先天性免疫,特定条件下入侵宿主可以引起格拉泽氏病(Glsser’s disease),临床上以体温升高、关节肿胀、呼吸困难、多发性浆膜炎、关节炎和高死亡率为特征的传染病,严重危害猪群尤其是仔猪和保育猪的健康。目前,副猪嗜血杆菌病已经在全球范围影响着养猪业的发展,给养猪业带来巨大的经济损失。

当前针对副猪嗜血杆菌的治疗方法主要是应用抗生素治疗如 β - 内酰胺类,喹诺酮类,磺胺等常规药物。但是,由于兽医临床用药不规范以及抗生素类饲料添加剂的长期使用,副猪嗜血杆菌的耐药性持续增强,在中国南部地区副猪嗜血杆菌对喹诺酮类药物的耐药率高达 70.9%,磺胺类药物的耐药率高达44.5%,其中 23%的菌株具有多重耐药性,且呈现出逐年增加的趋势,致使临床上对副猪嗜血杆菌的防控与治疗的难度日益增加。因此,开发新型的生态可持续的抑菌药物及研发新型可持续防治策略显得尤为必要。

大蒜素(Allicin)是大蒜的球形鳞茎中所提取的挥发性油状物,已被证实是大蒜提取物中最有效的抑菌成分。近年来,从化学、药理和临床应用等角度的研究发现大蒜素杀菌力强,可抑制多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌以及真菌等微生物。大蒜素在医药方面的广泛应用显示出对畜牧养殖业疾病防控的应用潜力。但目前在畜牧业方面的基础和临床应用的研究很少,而且大蒜素针对动物疾病病原的药理学及作用机理研究几乎没有涉及。目前对大蒜素的药理学机理研究主要集中在生物化学及相关酶的活性的影响。大蒜素可与脱氢酶、硫氧环蛋白还原酶、RNA 聚合酶上的巯基结合,从而影响半胱氨酸蛋白酶的活性。COPPI 等在研究中得知,大蒜素能够抑制囊胞蛋白酶的活性,可以阻止孢子的侵袭感染和降低老鼠血液中寄生生物的数量。BAKRI 等也在口腔感染细菌的培养实验中证明,蒜素能够抑制胰蛋白酶的活性。此外大蒜素对铜绿假单胞菌,金黄色葡萄球菌以及白色念珠菌等病原菌的生物被膜形成有很强的抑制所用。大蒜素抑菌机理研究表明其主要影响相关酶的活性和 DNA 转录。但是对于大蒜素能否抑制副猪嗜血杆菌以及相关作用的分子调节机制现在并不清楚。

基于此,本研究主要集中探讨大蒜素是否能够对副猪嗜血杆菌产生抗菌活性以及亚抑菌浓度的大蒜素对副猪嗜血杆菌作用的分子机理,为大蒜素应用于临床防控副猪嗜血杆菌提供理论指导。

1、材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌株 

7 株血清型均为Ⅴ型的副猪嗜血杆菌临床分离株:H9、H10、H14、H15、H17、H45、H46,副猪嗜血杆菌参考菌株猪 HS80(日本)、SW124、SW125(德国)。

1.1.2 试剂与仪器

 氨苄西林及大蒜素标准品均购自中国药品生物制品检定所。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NicotinamideAdenine Dinucleotide,NAD)购自 sigma;胰大豆蛋白琼脂(Tryptic Soy Agar,TSA)和胰大豆蛋白肉汤(TrypticSoy Broth,TSB;购自美国 BD 公司);Dimethyl sulfoxide (DMSO,购自 Sigma);RNAprotect Bacteria Reagent and RNeasy Protect kits (QIAGEN);SYBRPremixExTaq TM (Takara);紫外可见分光光度计UV-2600(尤尼柯公司);酶标仪(Tecan,Infinite F50);LightCycler 480Ⅱ实时荧光定量 PCR 仪。

1.2 实验方法

1.2.1 最小抑菌浓度( MIC) 的测定 

用 Dimethyl sulfoxide 将大蒜素标准品稀释储藏浓度 40 mg/mL,分装于 -20 ℃保存备用。参照 Clinical And Laboratory Standards Institute (CALSI)所述方法,以氨苄西林为对照,采用微量肉汤稀释法测定大蒜素对副猪嗜血杆菌的最小抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentra-tion,MIC)。将菌液约 1×10 5 CFU 接种于含不同药物浓度的 96 孔微量板中,37 ℃培养 24~48 h,观察结果,测定大蒜素对各菌株的 MIC 值 。

1.2.2 亚抑菌浓度大蒜素作用下副猪嗜血杆菌的生长曲线

 挑取 -80 ℃冻干保存的 H46 在 TSA 平板划线复苏并复壮,挑取单菌落接种于 5 mL TSB 液体培养基,37 ℃,190 r/min 振荡培养 12 h 左右作为种子液,菌体浓度约为 4.6×10 9 CFU/mL。取 4 只锥形瓶分别加 200 mL TSB 液体培养基,参照 Leng 等 抗菌药物亚抑菌浓度梯度的设置方法,向锥形瓶中分别加入终浓度为 0、8、12、16、32 μg/mL 的大蒜素,取上述种子菌液 2 mL 按培养基总体积的 1%接种于200 mL TSB 中,于37 ℃,190 r/min 振荡培养,每间隔 1 h 取一次样进行平板菌落计数,用紫外可见分光光度计 UV-2600 测定培养基的 OD 600 值并记录实验结果。

1.2.3 大蒜素对副猪嗜血杆菌生物被膜形成的影响 

试管法分析生物被膜的形成在玻璃试管(13 mm×100 mm)中加入 1 mL 的 TSB 培养基,分别加入 0、8、16 μg/mL 浓度梯度的大蒜素,接入 100 μL 新鲜菌液,空白培养基(加 DMSO)作为对照组并重复 3 次。在 37 ℃下静置培养 18 h,移除菌液并用 PBS 轻轻冲掉游离菌体,于室温下用 1.5 mL 的 1%结晶紫溶液染色 5 min,之后用流水冲洗 3~5 min 直至滴出的水无色为止,自然风干后拍照记录。

微孔板法分析生物被膜的形成,进行微孔板上生物被膜形成定量分析。无菌的聚苯乙烯96 孔板每孔中加入 100 μL 的 TSB 培养基,并接入10 μL 过夜培养的新鲜菌液,盖上盖子振荡混匀,37 ℃培养 36 h,每个药物浓度设 3 次重复。培养结束后弃掉菌液并用 200 μL 的无菌 PBS 洗涤微孔3 次,以去掉浮游和松散的菌体细胞。吸附紧密的细菌用 100 μL 的甲醇固定 15 min,之后吸去甲醇在空气中晾干,每孔加入 100 μL 1%的结晶紫溶液在室温染色 5 min,移除剩余染料并用蒸馏水冲洗 96 孔板直至冲洗液无色为止。随后,微孔板在 37 ℃下放置 30 min 以彻底干燥,之后加入 100 μL 33%(V/V)的冰乙酸溶解结晶紫,测定 630 nm 处的吸光度(A)。每组 3 次重复,以未接菌的空白培养基作为阴性对照。定义阈值(Ac)为阴性对照组 A 值的 2 倍。根据所测得的 A 值,把(A≤Ac)定义为无生物被膜形成能力,生物被膜形成能力较弱(Ac≤A≤2Ac),强生物被膜强形成能力(A≥2Ac)3 类。每个实验 3 次独立重复。

1.3 大蒜素对副猪嗜血杆菌部分基因表达的影响

1.3.1 菌株的大蒜素处理 

在 3 个 250 mL 的锥形瓶中分别加入 100 mLTSB 培养基,将复苏复壮后浓度 4×10 9 CFU/mL H46 株种子菌液 1 ∶ 100(v/v)转接到锥形瓶中。在 37 ℃下,190 r/min 振荡培养至  OD600    达到0.3,分别加入终浓度为0,8 和16 μg/mL 的大蒜素处理50 min,收集菌体提取 RNA,每个浓度处理的样品收集 3 个生物重复。

1.3.2 RNA 提取和定量 PCR

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用 RNAprotect Bacteria Reagent and RNasey Protect kits (Qiagen) 提取细菌 RNA。收集菌液后,每 5×10 8 个细胞加 1 mL RNA protect reagent,震荡混匀后,室温下静置孵育10 min,5 000 g 离心 5 min,移除上清液,于 -80 ℃保存备用,加溶菌酶室温下振荡孵育 5 min,提取方法参照试剂盒说明,应用 Agilent2100Bio-analyzer 检测 RNA 的质量、完整性和浓度。应用 TakaraRNAPCR-kit(AMV)Ver3.0 将 RNA 反转录成为 cDNA,存放于 -20 ℃备用。荧光定量 PCR 所用引物如(表1)。应用 SYBRPremixExTaqTM(Takara)在 LightCycler 480 Ⅱ实时荧光定量 PCR 系统中进行反应。反应体系为 20 μL,采用两步法 PCR 扩增程序,循环参数为:95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,运行 40 个循环。溶解曲线分析:95 ℃ 0 s,65 ℃ 15 s,95 ℃ 0s 。所有样品均为 3 个生物重复,每个生物重复做两个技术重复,并以 ppiB 作为参照基因。

1.4 统计学分析

实验数据以平均值±SE 表示,独立样本之间的统计分析采用 student’s test 分析,药物梯度处理的样品采用 one-way ANOVA 分析,P<0.05 认为差异有统计学意义。数据用 SPSS12.0 统计软件进行分析。

2、结果与分析

2.1 大蒜素对副猪嗜血杆菌的抑菌活性

为研究大蒜素对体外培养的副猪嗜血杆菌是否有抑菌活性,我们以氨苄西林作为对照,测定了大蒜素标准品对副猪嗜血杆菌的 7 个临床分离株和 3 个标准株的 MIC。结果表明大蒜素在体外对副猪嗜血杆菌具有抗菌活性,MIC 范围在16~32 μg/mL(表2),这说明大蒜素在体外对副猪嗜血杆菌具有较高的抑菌活性。

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2.2 亚抑菌浓度大蒜素条件下副猪嗜血杆菌的生长曲线

为了研究亚抑菌浓度大蒜素对副猪嗜血杆菌生长的影响,我们选取高致病性的临床分离株 H46 作为受试菌研究大蒜素的作用效果。结果发现 8、12、16 μg/mL亚抑菌浓度的大蒜素均表现出不同程度的抑菌效果,32 μg/mL 的大蒜素能够显著抑制副猪嗜血杆菌的生长(图 1),这进一步说明大蒜素在体外对副猪嗜血杆菌有较好的抑制效果。

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2.3 亚抑菌浓度条件下大蒜素对副猪嗜血杆菌生物被膜形成的影响

生物被膜是介导病原菌产生耐药性和免疫逃避的重要因素。为观察大蒜素对体外培养条件下的副猪嗜血杆菌生物被膜的抑制作用,我们选取了具有强生物被膜形成能力的临床分离株 H46 作为受试菌,观察其在 8 μg/mL 和 16 μg/mL 的大蒜素作用下生物被膜形成能力的影响。在 8 μg/mL 和 16 μg/mL 两个浓度的作用下,H46 株的生物被膜形成能力分别明显受到抑制(P<0.01)(图 2)。结果表明大蒜素在亚抑菌浓度条件下即可很好的抑制体外培养的 H46 株生物被膜的形成。

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2.4 亚抑菌浓度条件下大蒜素对副猪嗜血杆菌部分毒力因子表达的影响

为进一步研究大蒜素是否通过调节毒力相关基因的表达从而抑制副猪嗜血杆菌毒力。我们通过定量PCR 方法分析不同浓度的大蒜素对毒素相关基因的表达水平,结果发现 hhdA 在经过 8 μg 和 16 μg 的处理之后,表达水平显著降低(P<0.01)。而辅助 hhdA 起作用的另外一个亚基 hhdB 相关的基因,在经过 8 μg 大蒜素处理之后,表达水平不变,但是在 16 μg 处理之后,表达水平上升(图 3)。这些结果表明,大蒜素可通过抑制溶血毒素的主亚基 hhdA 的表达水平,降低毒力。

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大蒜素能够显著抑制副猪嗜血杆菌的生长增殖和生物被膜的形成,为进一步探究大蒜素对副猪嗜血杆菌的作用机理和影响。我们检测了调控细胞膜锚定蛋白合成的基因 mviN 和抗生素外排泵相关基因 norM 在大蒜素处理过程中的表达趋势。结果发现,基因 mviN 和 norM 的表达水平在 8 μg/mL 和16 μg/mL 条件下表达水平均下调(P<0.05)(图 4 A、B)。因而,这些结果显示通过抑制 mviN 和 norM的表达降低抗生素抗性是大蒜素抑制副猪嗜血杆菌的重要机制。

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3、讨 论

本研究首次探讨了大蒜素对副猪嗜血杆菌的抑制效果,并且对大蒜素抑制副猪嗜血杆菌生长的分子机理做了初步探讨。研究发现大蒜素在体外能够显著抑制副猪嗜血杆菌的生长和生物被膜的形成,并且对溶血素以及细菌生存相关的基因有不同程度的调节。

3.1 大蒜素能显著抑制副猪嗜血杆菌的体外生长

本研究发现大蒜素对副猪嗜血杆菌的 MIC 范围在 16~32 μg/mL,并且通过亚抑菌浓度的大蒜素对生长曲线的影响分析发现,大蒜素在体外对Ⅴ型副猪嗜血杆菌 H46 株的生长增殖有明显抑制,并且能够抑制其生物被膜的形成。之前已有研究报道发现大蒜素标准品对金黄色葡萄球菌的 MIC 范围在 32~64 μg/mL  ,大蒜素水提物对肺炎链球菌的 MIC 为 500 μg/mL。生物被膜是一个以多糖为基质包裹众多细菌并可固植于宿主组织表面的高度组织化的结构,是介导细菌耐药和免疫屏障的重要因素之一,同时生物被膜的形成是细菌慢性感染性疾病的重要特征。生物被膜的形成增强副猪嗜血杆菌的致病性和耐药性。大蒜素对副猪嗜血杆菌生物被膜的抑制实验发现不同的亚抑菌浓度大蒜素对 H46 生物被膜的形成能力有显著抑制,这说明,大蒜可通过抑制生物被膜的形成,从而达到甚至增强抑菌效果并降低副猪嗜血杆菌的致病性和耐药性。而前人的研究也发现对大蒜素能够抑制多种病原菌的生物膜形成。因此大蒜素可通过抑制副猪嗜血杆菌生长增殖和生物被膜形成,从而达到抑制副猪嗜血杆菌的活性。

3.2 大蒜素对副猪嗜血杆菌的作用机理

目前大蒜素对副猪嗜血杆菌作用机理并不清楚,本研究有针对性的选取了与副猪嗜血杆菌的毒力因子和抗生素抗性等基因,通过定量 PCR 对副猪嗜血杆菌相关的基因表达水平进行了分析。首先,我们发现大蒜素能够显著抑制 hhdA 的表达水平。溶血素基因 hhdA 和 hhdB 与杜克雷嗜血杆菌菌、沙雷氏菌等病原菌中的序列具有高度同源性,在杜克雷嗜血杆菌中 hhdA 表达为溶血素 A,其可以与靶细胞膜结合并裂解靶细胞。hhdB 表达为溶血素 B,HhdB 是外膜的结构蛋白用于分泌并激活溶血素 A 。虽然其在副猪嗜血杆菌中的作用机理还未明了,本研究发现在大蒜素的影响下 hhdA 的表达量明显降低,而 hhdB 的表达水平明显上升,因此我们推测可能是由于 hhdA 的表达受到抑制而引起 hhdB 的表达代偿性升高。同时有研究证明大蒜素可在体外条件下降低肺炎链球菌的溶血活性。因此我们认为,大蒜素能够通过抑制溶血素基因表达,从而达到抑细菌致病性的效果。其次,我们分析了毒力相关基因mviN 和抗生素抗性基因 norM 的表达水平,初步探讨大蒜素对副猪嗜血杆菌抑制作用机理。mviN 基因编码一种肽聚糖脂Ⅱ翻转酶,其作用是对合成细菌外膜锚定蛋白的前体肽聚糖加工修饰,是细菌生长繁殖所必需的,此外 mviN 的表达受细菌的群体感应系统调控。由于 mviN 序列在革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌中具有高度同源性以及其对细菌生长的必要性,可将其作为靶位点开发新型的抗菌药物。mviN 也是副猪嗜血杆菌重要的潜在毒力因子,在副猪嗜血杆菌感染脑组织和肺组织过程中发挥重要所用。研究发现,群体感应抑制剂大蒜素作用下,mviN 基因表达即受到明显抑制,因此通过抑制 mviN 的表达从而抑制副猪嗜血杆菌的生长是大蒜素的抑菌机制之一。norM 基因编码细菌的 Drug-  Na  +    逆向转运蛋白,在副猪嗜血杆菌中可介导诺氟沙星,环丙沙星,链霉素等多种抗生素的外排。大蒜素对抗生素外排泵基因 norM 表达的抑制作用,暗示大蒜和抗生素的联合使用可提高抗生素杀菌活性,降低菌株对抗生素的耐药性。这与前人发现大蒜素可降低多种抗生素 MIC 的研究结果相吻合。该研究结果说明大蒜素可以作为临床抗生素使用的重要替代物,发挥其特点,在其单独用药或联合用药方面均可发挥特殊的作用。

为了探索针对严重危害养猪业的副猪嗜血杆菌病的新型治疗药物,本研究首次分析了大蒜素对副猪嗜血杆菌体外培养的影响,发现大蒜素对副猪嗜血杆菌的体外生长和生物被膜的形成抑制作用明显,并且对副猪嗜血杆菌多个毒力相关基因表达有明显的抑制,该发现为大蒜素临床用于副猪嗜血杆菌的防治提供了重要的理论基础,同时为大蒜素对细菌抗毒力策略研究提供了重要的实证。此外,本研究还发现大蒜素可以抑制抗生素外排泵 norM 的表达,这说明大蒜素和抗生素的联合使用可能会显著提高副猪嗜血杆菌的治疗效果,同时也为探索大蒜素与抗生素的联合使用的新型药物策略提供了理论基础。

专家介绍
俞道进 

作者介绍:俞道进博士,现任福建农林大学动物科学学院教授、硕士生导师、系主任。中国畜牧兽医学会药理与毒理学分会常务理事。2003年华南农业大学基础兽医学专业研究生毕业,获博士学位。

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