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表达H5 亚型禽流感病毒不同形式HA 基因重组鸭瘟病毒的构建及HA 表达形式的鉴定
  

摘要:为研究禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)基因的信号肽以及跨膜区对HA 蛋白在重组病毒中表达的影响,本研究以鸭瘟病毒(DEV)为载体,在DEV 基因组的US7 和US8 基因之间通过同源重组插入去除信号肽或跨膜区的H5N1 亚型AIV HA 基因编码序列,分别构建了缺失信号肽HA 基因的DEV 重组病毒(rDEV-PK)和缺失跨膜区HA 基因的DEV 重组病毒(rDEV-PSM),并传至20 代,经PCR 对插入的外源基因编码序列扩增及序列测定,表明外源基因能够在重组病毒基因组中稳定存在;间接免疫荧光和western blot 鉴定结果表明去除信号肽的HA 蛋白能够在重组病毒感染的鸡胚成纤维细胞浆中正确表达,而去除跨膜区的HA 蛋白能够在感染细胞的培养液中检测到。本研究为表达H5N1 亚型AIV HA 基因重组DEV 载体弱毒疫苗在鸭体内免疫机制的进一步研究奠定基础。

禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)是正粘病毒科有囊膜多形态单股负链RNA 病毒。多数家禽均可以感染发病,严重威胁养禽业,也是最重要的人兽共患病病原之一,并威胁人类健康。AIV通过结构蛋白识别宿主细胞表面受体并与受体结合感染细胞,其中HA 蛋白作为最重要的保护性抗原,已成为各类抗流感疫苗研究的靶蛋白。

在高致病性AIV (HPAIV)感染宿主细胞过程中,HA 蛋白首先以完整的血凝素蛋白(HA0)的形式合成,当流感病毒吸附于细胞表面后,HA0 在蛋白酶的作用下裂解为HA1 和HA2。其中,HA1 具有与宿主细胞受体结合的特性,HA2 N 末端的疏水序列可以与细胞膜融合,是参与和细胞膜融合的重要亚单位。目前,用作疫苗研究的AIV HA 基因均缺失碱性裂解位点。HA 基因编码序列经由载体导入细胞后,可在核糖体中表达完整的HA 蛋白,在信号肽作用下,HA 蛋白穿过内质网膜、转移至高尔基体并将成熟的HA 蛋白转移至细胞膜上,研究表明跨膜区对蛋白活性和基因表达也存在影响。HA基因缺失信号肽后,表达的HA 蛋白不能正常的转移到细胞膜上;HA 基因缺失跨膜区后,表达的HA蛋白将被分泌到细胞外。

本实验室前期研究中已构建表达AIV HA 基因重组鸭瘟病毒(Duck enteritis virus,DEV),免疫鸭后可以在鸭体内诱导产生对同源AIV 坚强且快速的免疫保护。为阐明重组病毒诱导产生对AIV 快速免疫保护的免疫机制,在本实验室已建立的DEV 弱毒疫苗株拯救系统基础上,利用RedE/T 同源重组技术和Gateway LR 克隆技术,以SV40 作为启动子的不同形式的HA 基因编码序列插入DEV 复制非必须区US7 和US8 之间,分别构建了表达缺失信号肽的HA 基因重组DEV (rDEV-PK) 和缺失跨膜区的HA基因重组DEV (rDEV-PSM)。以检测缺失信号肽或缺失跨膜区对HA 蛋白在重组DEV 基因组中表达特性的影响,为疫苗保护性抗原不同提呈方式对疫苗保护效果的影响研究奠定基础。

1、材料和方法

1.1 病毒株、重组质粒及细胞H5N1 

亚型AIV A/duck/Hubei/49/2005 株( 简称HB/49) 由国家禽流感参考实验室分离、鉴定和保存;AIV HA 基因重组DEV 疫苗株(rDEVus78Ha 株)由本实验室构建;DEV疫苗株拯救系统,即粘粒(Fosmid) A、F、J、P、T,T-us78Kan ccdB 粘粒及pENTR-MCS 质粒均由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所构建和保存;鸡胚成纤维细胞(CEF)按常规方法制备。

1.2 主要试剂

DNA 聚合酶、T4 连接酶和限制性内切酶均购自TaKaRa 公司;兔抗鸡IgG-HRP、羊抗鸡IgG-FITC 均购自Sigma 公司;胶回收和质粒提取试剂盒购自QIANGEN 公司;pSI 质粒购自Promega公司;磷酸钙转染试剂盒Gateway Vector Conversion System with One Shot ccdB SurvivalTM 2T1R Competent Cells、LR Clonase II enzyme 克隆试剂盒购自Invitrogen 公司;病毒DNA 提取试剂盒购自天根生化科技( 北京) 有限公司; 蛋白浓缩超滤管购自Millipore 公司;H5 亚型AIV 标准阳性血清由本实验室制备。

1.3 表达缺失信号肽或跨膜区HA 基因重组质粒的构建

重组质粒和粘粒构建,根据HB/49 株的HA 基因,通过软件分析确定HA 基因的信号肽和跨膜区位置,分别利用Hapkf/Hapkr和Hapsmf/Hapsmr 两对引物(表1),PCR 扩增缺失信号肽或缺失跨膜区基因的HA 基因片段。分别胶回收PCR 产物经Mlu Ⅰ/Sal Ⅰ酶切后克隆于pSI 质粒中,构建pSI-PK 和pSI-PSM 重组质粒。

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利用引物Entryhar/Entryhaf 从上述构建的pSI-PK和pSI-PSM 中分别扩增缺失信号肽和缺失跨膜区的HA 基因,并利用BamHⅠ酶切将其克隆于pENTR-MCS中,构建重组质粒pENTR-PK 和pENTR-PSM。

按Gateway LR 克隆方法将T-us78Kan ccdB 分别和pENTR-PK 或pENTR-PSM混合,并加入LRClonase II enzyme,使pENTR-PK 和pENTR-PSM 中的SV40-HApk 或SV40-HApsm 替换T-us78Kan ccdB 中的Kan ccdB 基因,从而获得在US7 和US8 之间插入SV40-HApk 或SV40-HApsm 序列的粘粒T-us78HApk和T-us78HApsm (图1)。

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1.4 重组病毒的拯救

将线性化重组粘粒T-us78HApk和T-us78HApsm 与另外4 个粘粒,即“A+F+J+P”,利用磷酸钙转染试剂盒共转染次代CEF 细胞,如图1 所示,分别拯救出表达缺失信号肽和缺失跨膜区HA 基因的重组病毒。

1.5 重组病毒的PCR 鉴定

提取各重组病毒第20代病毒DNA,利用位于外源基因插入位点两侧的PCR 引物Pus78dr/Pus78df 进行PCR 扩增,检测外源基因在重组病毒基因组中插入情况。并对扩增的PCR 产物进行测序,分析外源基因在重组病毒基因组中是否有突变或缺失。

1.6 重组病毒的间接免疫荧光试验(IFA)鉴定

分别将rDEVus78Ha、rDEV-PK 和rDEV-PSM 病毒以MOI=1.0 的剂量感染CEF 细胞。48 h 后用4 %多聚甲醛室温固定30 min,依次以AIV 阳性血清(1∶1 000)37 ℃孵育1 h,羊抗鸡IgG-FITC (1∶2 000) 37 ℃避光孵育1 h,各步骤之间用PBS 洗3 遍,每次5 min,利用荧光显微镜进行观察。

1.7 重组病毒的western blot 鉴定

分别将rDEVus78Ha、rDEV-PK 和rDEV-PSM 病毒以MOI=1.0的剂量感染CEF 细胞,培养至细胞病变(CPE)达到80 %,分别收集细胞和细胞培养上清。收集的细胞培养上清用50 ku 超滤管浓缩20 倍,收集的细胞用细胞裂解液裂解,分别进行SDS-PAGE 电泳、半干法转至硝酸纤维素(NC)膜上,5 %脱脂乳室温封闭2 h,以AIV H5 阳性血清(1∶1 000)为一抗,兔抗鸡IgG-HRP (1∶1 000)为二抗,通过ECL 底物显色进行western blot 鉴定。

1.8 重组病毒一步生长曲线的测定

将rDEVus78Ha、rDEV-PK 和rDEV-PSM 分别以MOI=0.01 的剂量接种CEF 细胞。并分别在感染后不同时间点收集样品,储存于-70 ℃,最后统一进行TCID50 的测定。

2、结果

2.1 不同区域HA 基因的扩增及重组质粒的鉴定

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以AIV HB/49 株HA 基因为模板,PCR 扩增得到去除信号肽的HA 基因(PK)和去除跨膜区的HA 基因(PSM),大小分别为1 603 bp 和1 638 bp (图2),测序结果正确。将PK 和PSM 分别克隆于pSI 质粒,再以其为模板分别扩增出PK 和PSM 基因,将其克隆于pENTR-MCS 质粒中, 获得重组质粒pENTRPK和pENTR-PSM,通过Mlu Ⅰ/Sal Ⅰ限制性内切酶对其进行双酶切鉴定,结果表明,PK 和PSM 均正确插入质粒中。并通过Gateway LR 克隆方法构建在DEV 的US7 和US8 之间插入SV40-HApk 或SV40-HApsm 序列的粘粒T-us78HApk 和T-us78HApsm。

2.2 重组病毒的拯救以

DEV 弱毒株同源重组拯救系统为基础,将线性化重组粘粒T-us78HApsm 和T-us78HApk 与相互重叠覆盖DEV 全基因组的4 个粘粒,即“A+F+J+P”,利用磷酸钙转染试剂共转染次代CEF 细胞,转染后7 d 左右开始出现CPE,表明拯救出去除信号肽和去除跨膜区的H5N1 亚型AIV HA 基因表达框架的重组DEV,并分别命名为rDEV-PK 和rDEV-PSM。

2.3 重组病毒的PCR 鉴定

将重组病毒rDEV-PK和rDEV-PSM 传至第20 代,提取病毒DNA,利用PCR 方法进行鉴定, 结果表明, 重组病毒rDEVus78Ha、rDEV-PSM 和rDEV-PK 均能扩增出大于3 000 bp 的基因片段产物,而亲本病毒DEV 基因组中因无外源基因的插入,其扩增片段长度约400 bp,均与预期大小相同(图3)。测序结果表明在重组病毒基因组中,外源片段均正确插入,而且无突变或无缺失。

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2.4 重组病毒的IFA 鉴定

将重组病毒rDEVus78Ha、rDEV-PK、rDEV-PSM 和亲本病毒DEV 感染CEF 细胞, 采用IFA 方法鉴定重组病毒中rDEV-PK 和rDEV-PSM 中HA 基因的表达情况。结果表明,去除HA 基因信号肽的重组病毒rDEV-PK 表达的HA蛋白存在于胞内,而去除了HA 基因跨膜区的重组病毒rDEV-PSM 的HA 蛋白表达量显著低于前两种重组病毒(图4)。

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2.5 重组病毒的western blot 鉴定

将rDEVus78Ha、rDEV-PK 和rDEV-PSM 感染CEF 细胞,分别裂解细胞和浓缩细胞培养液,进行western blot 鉴定。结果表明,rDEVus78Ha 和rDEV-PK 的HA 蛋白均能够在裂解的细胞中检测到,而rDEV-PSM 在裂解的细胞中因其含量低而难以检测到。在rDEV-PSM 感染浓缩的细胞培养液中能够检测到HA 蛋白,而另外2 株重组病毒感染浓缩细胞培养液中检测不到HA蛋白(图5)。

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2.6 重组病毒的生长动力学曲线

将rDEVus78Ha、rDEV-PK 和rDEV-PSM 分别以MOI=0.01 的量接种CEF 细胞。并分别在感染后不同时间点收集样品,绘制其生长曲线。结果表明,重组病毒rDEV-PK 和rDEV-PSM 生长曲线与DEV 疫苗株一致,各时间点病毒滴度与DEV 无明显差异(p>0.05)。表明重组病毒rDEV-PK 和rDEV-PSM 在CEF 中的复制特性与DEV 一致(图6)。

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3、讨论

前期研究表明,表达H5 亚型AIV 完整HA 基因的重组DEV 弱毒疫苗株在鸭和鸡中安全有效,并且免疫后3 d 即可诱导能够抵抗H5 亚型AIV 攻击的特异性免疫保护力。HA 蛋白是决定AIV 毒力强弱的关键蛋白之一,在病毒黏膜吸附、侵入过程中起关键作用。HA 蛋白也是AIV 最重要的保护性抗原。

本研究基于已建立的DEV 拯救系统, 采用Gateway LR 克隆技术,以SV40 作为启动子,将H5亚型AIV 缺失信号肽或跨膜区编码序列的HA 基因插入DEV 基因组的复制非必须区,即US7 和US8基因之间, 拯救出2 株重组病毒rDEV-PK 和rDEV-PSM,并稳定传至20 代。通过PCR 扩增和测序鉴定,外源基因均正确插入,并且无突变、无缺失;IFA 和western blot 试验证明插入的不同形式的HA 基因均能够稳定表达;此外,一步生长曲线的结果证明外源基因的插入对病毒的增殖没有影响,重组病毒具有与亲本毒株相似的生长特性。实验结果表明去除HA 蛋白信号肽或跨膜区均不影响该蛋白在病毒活载体中的表达,但因信号肽或跨膜区的缺失,rDEV-PK 表达的HA 缺失信号肽,使该病毒表达的HA 蛋白不能被引导至细胞内含不同膜结构的亚细胞器,而蓄积于细胞浆中,导致其表达的HA 蛋白只能在胞内被检测到;rDEV-PSM 表达的HA 基因缺失了该基因的跨膜区,而使HA 蛋白不能被锚定于细胞膜上,无法在细胞内进行累积,进而只能在细胞培养液上清中被检测到。

本研究制备了表达缺失信号肽或跨膜区的HA基因的重组DEV,并且外源基因的插入和表达对DEV 本身的复制效率无影响。本研究结果为体内评价表达AIV 不同形式HA 重组DEV 疫苗株的保护效果奠定了基础。

专家介绍
陈化兰 

作者介绍:陈化兰,甘肃省白银市人,博士,研究员,博士生导师,动物传染病及预防兽医学专家。中国农业科学院兽医兽药学科"一级岗位杰出人才"。任世界动物卫生组织(OIE)生物标准委员会委员,OIE/国际粮农组织(FAO)禽流感专业委员会执行委员,OIE禽流感专家。中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室主任,国家禽流感参考实验室主任,OIE禽流感参考实验室主任

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