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2 株与疫苗病毒高度同源的猪繁殖与呼吸综合征病毒的鉴定和致病性分析
  


摘要:为了解河南地区猪繁殖与呼吸综合征病毒( PRRSV )流行毒株的特征及致病性,对从河南省两个免疫过高致病性PRRSV ( HP-PRRSV )减毒活疫苗后不久发病猪场分离的两株PRRSV HENZK-1和 HENPDS-2进行了全基因组测序、分析和致病性研究。结果表明,两株PRRSV分离株与 HP-PRRSV的细胞传代致弱疫苗株JXA1-P80/JXA1-R高度同源。致病性试验表明,感染 HENZK -1和 HENPDS-2的仔猪出现明显临床症状,包括高热、食欲减退、呼吸困难等,且肺部出现了肉眼和组织学病变;而同源商品疫苗对照组JXA1-R虽未出现明显临床症状,但日增重降低,肺部有肉眼和组织学病变,并检测、回收到病毒。综上所述,有理由认为 HENZK -1和 HENPDS-2是由 HP-PRRSV疫苗株JXA1-R演化而来,其来源猪群临床发病与其毒力返强、疫苗毒株在解剖和组织学上的损伤和排毒能力有一定关系,但具体原因仍需进一步研究。本研究为谨慎使用高致病性 PRRSV 减毒活疫苗及 PRRS控制策略提供了重要依据。

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PPRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PPRSV)引起的一种传染病,主要造成妊娠母猪繁殖障碍、引发吮乳仔猪死亡及各生长阶段猪的呼吸道症状。该病最早于 1987 年在美国报道,目前已蔓延至全球主要养猪国家和地区。中国于1995年首次报道该病,次年从猪流产胎儿中分离到 CH-1a 株。 2006 年,猪的的一种严重传染病开始在中国南方部分地区暴发,后迅速蔓延至全国大部分猪群。由于其传播快、发病率及死亡率高,给养猪业造成了巨大损失。高致病性PRRSV ( HP-PRRSV )是引发该疫情的主要病原,并逐渐成为国内 PRRSV 优势流行毒株。近年来HP-PRRSV弱毒活苗被广泛使用,虽然对疫病防控起到了一定作用,但这些弱毒疫苗毒株在选择压力及免疫压力的双重作用下存在毒力返强的风险,甚至出现了类疫苗株逐渐在田间流行的趋势。近年来,类 NADC30 毒株在中国出现并逐渐成为继 HP-PRRSV 之后的又一田间优势流行毒株,且该毒株具有易与其它 PRRSV 毒株发生重组的特点 。

因此,目前中国面临多种类型 PRRSV 毒株共存的局面,这些毒株不仅在基因水平上有所差异,而且在毒力、致病性等方面也不尽相同,从而加大了该病的防控难度。因此,在了解 PRRSV 基因变异的同时有必要对其致病力变化进行研究,以期深入了解该病毒的演变及进化特征。本研究利用 2014~2015年来自河南省暴发 PRRS的猪场的病料分离到多株PRRSV ,经鉴定其中有2株为 HP-PRRSV 疫苗类似毒株,遂对其进行了全基因组测序、序列分析及致病性研究,以期为了解河南省 PRRSV 流行株的遗传进化特征及致病性变化和该病的防控及疫苗研发提供科学依据。

材料与方法

1、病料采集

共采 集 167 份 病 料,其 中 RT-PCR 检 测 出PRRSV 阳 性 病 料39 份,分 离 并 鉴 定 为 类 HP-PRRSV 疫苗毒株的两份病料分别采自河南省周口市和平顶山市。经 HP-PRRSV JXA1-R 株弱毒活疫苗免疫猪场的发病或病死猪,其肺脏、脾脏及淋巴结等研磨后置-70℃保存备用。

2、菌株、毒株及载体

E.coli DH5α 感受态细胞及 PRRSV 参考毒株( HP-PRRSV毒株 HENAU-QBS-2 )由河南农业大学禽病研究所保存;高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R 株),购自国内某动物生物制品企业,生 产 批 号: XX01007A ;pMD18-T 克 隆 载 体 及Random 引物购自宝生物工程(大连)有限公司。

3、试验动物

4~6 周龄的血液 PRRSV 抗体检测阴性及相关病原( PCV、PRV 、 PPV 、 PRRSV 、 PEDV、 CSFV 、TGEV 等) PCR 或 RT-PCR 鉴定阴性的临床健康断奶商品仔猪购自河南省某种猪场。

4、主要试剂及细胞

RNAiso Plus 、鼠 源 反 转 录 酶 ( M-MLV )、dNTP 、 RNA 酶抑制剂 ( Rnase Inhibitor)和 DNAMarker DL2000 等购自宝生物工程(大连)有限公司;琼脂糖购自 Sigma 公司; 2xEsTaq MasterMix(含染料)购自北京康为世纪生物科技有限公司;胎牛血清( FBS )购自北京四季青公司;胰酶、DMEM培养基购自 Gibco公司; FITC 标记的羊抗鼠IgG荧光抗体及 DAPI染色液购自武汉博士德生物工程有限公司;IDEXX PRRS  X3Ab  Test试剂盒购自美国爱德士生物科技公司;抗美洲型 PRRSV N 蛋白单克隆抗体由河南农业大学田克恭教授惠赠;MARC-145 细胞由河南农业大学杨国宇教授惠赠;其他试剂均为国产分析纯。

5、引物设计与合成

使用郭天准等针对 ORF5基因设计的引物P3-F/R对细胞培养物进行 RT-PCR 检测;使用冷雪等设计的14对引物对 PRRSV 分离株进行分段扩增。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

6、病毒的分离与鉴定

将保存的样品经离心、过滤后取1ml滤液接种于 MARC-145细胞,置于37 ℃ 、5% CO   2 培养箱内孵育1h ,弃掉细胞上清并加入5ml含2% FBS的DMEM 继 续 培 养,观 察 细 胞 病 变 ( Cytopathiceffect,CPE), 2~4d收集细胞培养物。盲传3代后进行 RT-PCR检测,若出现 CPE且 PCR检测结果为阳性则将该细胞培养物继续传代 3 次,观察CPE 的稳定性并进行 RT-PCR 检测,同时通过间接免疫 荧 光 法 (Indirect  immunofluorescence assay,IFA)进行鉴定。

6.1  病料总 RNA的提取及 

RT-PCR检测取适量样品,参照 RNAiso Plus说明书提取总 RNA ,参考有关文献介绍的方法进行RT-PCR扩增。取适量 PCR 产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测。

6.2  IFA鉴定

用常规方法进行IFA 试验,试验结束后即刻加入300Μl DAPI并室温避光作用5min进行细胞核染色, PBS清洗并晾干后置于荧光显微镜下观察。

7、增殖动态绘制

两个分离株均按 MOI=0.01接种MARC-145细胞,在接种后每隔12h (直至96h )分别取样进行TCID 50 测定,绘制出各毒株增殖动态

8、全基因组的扩增、克隆及测

用PRRSV 全基因引物扩增出各毒株的各片段, PCR 产物回收纯化后与 Pmd18-T克隆载体连接,转化E.coli DH5α 感受态细胞,经Amp筛选及PCR鉴定后,将阳性菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

9、全基因组的遗传变异分析

用 DNAStar软件中的 MegAlign对分离株的全 基 因 组 进 行 序 列 比 对 和 相 似 性 分 析;利 用MEGA7.0软 件 中 的 邻 接 法 (neighbor-joining;bootstrap values of 1000 replicates)进行全基因组遗传进化分析并绘制系统进化树;用 RDP4对分离株全基因组进行重组分析。本研究所用参考毒株信息详见表 1 。

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10、致病性研究

将17头试验猪随机分为4组,第1组(5头)和第2 组 ( 5 头)为试验组,分别接种 2 ml PRRSV HENZK-1株(2× 10  5   TCID 50 )和 HENPDS-2株(2× 10  5   TCID 50),接种方式为1ml滴鼻+1ml肌注;第3组(5头)为本研究分离物来源发病猪场所用疫苗厂家市售同种 HP-PRRSV JXA1-R 商品株弱毒疫苗对照组,按说明书推荐方法肌注2ml (1头份);第4组(2头)为空白对照组,进行1ml DMEM 滴鼻及1ml DMEM 肌注处理。各组分圈饲养,观察临床表现并测量体温、体重;每7 d (第3 d加测)采血进行PRRSV 抗原、抗体检测及病毒载量测定;每7d 对各组猪只进行剖检(空白对照组在第 14 及 21d进行剖检)并制作病理切片,利用绝对荧光定量PCR对肺脏、脾脏进行PRRSV病毒载量测定;试验至21d结束后对第21d采集的样品进行病毒分离鉴定,并根据其 ORF5及NSP2序列测定结果判定回收到的毒株是否为该组接种所用毒株。


结果与分析

1、成功分离出两株PRRSV毒株

经病毒传代及 RT-PCR(图1 )和IFA(图2)鉴定阳性后,成功分离出两株 PRRSV 毒株( HENZK-1株 和 HENPDS-2 株),初 代 培 养 48h 均 出 现CPE,连续传代3次后可出现稳定且典型的CPE 。

2、两株PRRSV分离物增殖趋势相似

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经各毒株接种后定点收毒及 TCID 50 测定,获得了 2个分离株及对照株(HENAU-QBS-2)的增殖动态(图 3 )。 HENZK -1 和 HENPDS-2 株具有相似的增殖趋势,接种后病毒滴度迅速上升并在60h左右达到高峰,随后逐渐下降;而对照株虽与两者具有相似的增殖趋势,但总体滴度相对低一些。 3株毒株均能很好地适应 MARC-145细胞。

3、全基因组的遗传变异特征

成功扩 增 得 到 2 个 分 离 株 各 基 因 片 段。经DNAMAN软件拼接获得 HENZK -1和 HENPDS-2株全基因组序列,全长分别为15 319bp和15 320bp ,不 包 含Poly(A)。GenBank登 录 号 分 别 为ku950373和ku950370 。全基因组序列重组分析结果表 明, HENZK -1 和 HENPDS- 2 株 未 与 其 他PRRSV 毒株发生重组。

3.1  全基因组核苷酸序列及其推导的氨基酸序列相似性比较

分离株 HENZK -1和 HENPDS-2的核苷酸序列与lv 的相似性分别为60.8%和60.9%,与VR-2332的相似性分别为89.4%和89.6%,与CH-1a的相 似 性 分 别 为 94.9% 和 95.1% ,与 国 内 HP-PRRSV 的相似性分别为98.8%~99.5%和99.0%~99.8% 。其中, 2个分离株全基因及各 ORFs编码的蛋白分别与 JXA1各代次致弱毒株(JXAI-P10~P170)及其疫苗返强毒 NT1 、 NT2和 NT3高度同源。此外,同参考株编码区氨基酸序列的比对发现,在两个分离株中总共存在12个突变一致的氨基酸,与JXA1的传代致弱株(包括疫苗株JXA1-P80)及疫苗返强株NT1 、 NT2和 NT3相同,与其它 PRRSV均不相同;此外有个别氨基酸并未与JXA1的传代致弱株的特有氨基酸保持一致(图 4 )。

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3.2  全基因序列的遗传进化特征

分离 株 HENZK -1 和 HENPDS-2 均 属 于 以JXA1为代表的亚群4 ,同JXA1各代次致弱毒株(JXA1-P10~P170)及其 3个疫苗返强株NT1、NT2和 NT3一起分布在一个进化分支,且分别与JXA1-P45和 NT2遗传进化关系较近(图5)。

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4、 临床表现、体温变化及平均日增重

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攻毒后,攻毒组猪出现被毛凌乱、耳朵略微发绀、精神沉郁、食欲不振、呼吸困难等临床症状,空白对照组无明显的上述症状。疫苗组和空白对照组猪的体温在试验过程中并无明显升高,而试验组猪在攻毒后均出现了体温升高。 HENZK -1组猪体温升高最快,最高升至41.3℃ , HENPDS-2组的猪体温升高相对缓慢(图6A)。与空白对照组相比,攻毒组及疫苗组的平均日增重均相对较低,差异显著或极显著(图6B)。

5、PRRSV特异性抗体水平变化

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从特异性抗体水平变化曲线(图7)可以看出,攻毒或接种后各试验组和疫苗对照组猪只体内的PRRSV 特异性抗体水平逐渐升高并转为阳性,从第7d起迅速上升并持续到试验结束,其中抗体水平上升速度最快、水平最高的为 HENZK -1组,疫苗组相对于两个攻毒组较慢、较低,空白对照组抗体水平始终维持阴性不变。

6、肺脏剖检变化、病变得分及病理切片特征

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由肺脏临床剖检图片(图8 A)可看出,攻毒组及疫苗组猪只的肺脏主要出现间质增宽、出血点及局部坏死等解剖学病理变化,其中病变最为严重的是HENZZ-1组,HENPDS-2组次之,空白对照组猪只肺脏无肉眼可见变化。肺部病理切片(图8B )结果显示,空白对照组未发现组织学变化,而各攻毒组及疫苗组猪只的肺部均出现了间质性肺炎,肺泡间隔增宽,单核细胞浸润,肺泡腔变窄,支气管和细支气管的上皮细胞变性坏死等。

7、血液、肺脏及脾脏病毒载量比较

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利用绝对荧光定量 PCR测定出了各组猪只不同时 间 点 采 集 的 血 液 及 剖 杀 猪 只 的 肺、脾 脏 中PRRSV 载量(图9 A~C )。由于第 7d 只剖杀了HENZK -1组和JXA1-R 组,因此图中第7d的肺、脾脏中病毒载量未显示其他组的数值。试验第7 、14及21d各攻毒组及疫苗组猪只血液中病毒载量均高于空白对照组,差异极显著,表明攻毒组及疫苗组猪只均产生了病毒血症(图9A )。试验第14和21d 各攻毒组及疫苗组猪只肺脏、脾脏病毒载量均比空白对照组的高,其中,疫苗组与空白对照组相比差异显著,而各攻毒组同空白对照组相比差异极显著,且 HENZK -1组猪只的肺脏和脾脏病毒载量均最高(图9B、9C)。

8、不同组别PRRSV毒株回收鉴定

攻毒组及疫苗组均从肺脏成功回收到病毒,嚄ORF5及 NSP2 基因测序结果显示,各组回收到的毒株均为该组接种所用毒株,且未发生碱基突变,空白对照组未回收到病毒。

根据动物试验结果,商品活疫苗毒JXA1-R 接种猪只后,虽未表现出明显临床症状,但与空白对照组相比日增重较低,特别是其肺部有明显的解剖学和组织学病理变化;而与 JXA1-R 相比,类疫苗株HENZK -1 、 HRNPDS-2感染猪只后,既有明显的临床症状,又有典型的解剖学和组织学病理变化,因此,分离物和弱毒活疫苗株均有致病性,其致病性从强到弱依次为 HENZK -1 株、 HENPDS-2 株、弱毒活疫苗株。

讨    论

2006年 HP-PRRS在我国暴发并迅速蔓延,且使用灭活疫苗保护水平较低。2011年以来国产不同毒株 HP-PRRSV 活疫苗先后上市并广泛使用。但弱毒活疫苗在选择压力和免疫压力双重作用下存在毒力返强和与流行毒株发生重组的风险,加速了 PRRSV 的变异与进化。本研究从 39 份RT-PCR检测PRRSV阳性病料中共分离到6株病毒,其中有2株为类 HP-PRRS弱毒活疫苗病毒,占分离毒株的33.33% 。尽管分离毒株的样本比较小,不一定具有代表性,但是此比例已足以令人担忧。根据本研究结果和其他相关报道,并结合我国PRRS防控现状,有充分理由呼吁人们应对广泛使用 HP- PRRS弱毒活疫苗带来的风险引起高度重视。

本研究不但通过对两个分离物 HENZK-1和HENPDS-2 全基因序列分析确定其与疫苗株JXA1各代次细胞传代致弱毒株(JXA1-P10~P170 )及其3个疫苗返强株NT1、NT2、 NT3高度同源、同在一个小的进化分支,均属于疫苗源毒株,而且从病毒分离过程中分离物的细胞嗜性也提示其可能属于疫苗源毒株。因为 PRRSV 野生毒株在初次分离时一般比较困难,不容易适应MARC-145 传代细胞系,而多需使用猪肺泡巨噬细胞( PAM)方可成功获得初始分离物。但是本研究的两个分离物首次分离时就很容易在MARC-145 传代细胞上生长,因此推测其很可能与该病毒在疫苗研发阶段经多次传代早已适应了MARC-145传代细胞有关。

本文对PRRSV参试毒株的推导氨基酸序列分析发现, JXA1-P80存在 16 个特有的氨 基 酸,而HENZK -1和 HENPDS-2则分别含有 10个和 15个特有氨基酸与JXA1-P80保持一致,其他已知毒株不具有这种特征。因此,特有氨基酸系列从另一角度支持 HENZK -1和 HENPDS-2为两株类 HP-PRRSV JXA1-R 疫苗株。但是其余几个未保持一致的特有氨基酸是否为导致类 HP-PRRSV 疫苗株致病性增强的关键氨基酸尚有待进一步研究。

安全性是所有疫苗最重要的两个指标之一。Jiang等曾报道从江苏某未使用过 HP- PRRS弱毒活疫苗的发病猪场分离到类 HP-PRRS弱毒活疫苗病毒NT1、NT2和NT3 ,且其对易感仔猪具有很强致病性,但并未比对与其疫苗源亲本毒株之间的致病性差异和相关性。为了探讨两株分离物与其疫苗源亲本毒株之间的致病性差异和相关性,本研究对两个分离株和其疫苗源厂家的市售JXA1-R 株HP-PRRSV商品疫苗同时进行了接种试验。结果表明, HP-PRRSV 商 品 疫 苗 虽 然 不 像 分 离 物HENZK -1和 HENPDS-2那样导致感染猪出现明显临床症状,但与空白对照组相比却导致增重明显较低,并引起明显的解剖学和组织学病理变化,且回收到病毒。由此推测某些猪群用 HP-PRRSV 弱毒活疫苗免疫后出现临床发病,可能与疫苗毒株造成的病理学损伤和较强的排毒能力有一定关系,特别是对于健康状况欠佳的猪群其诱发临床发病的潜在风险更大。另外,类疫苗株 HENZK -1 及 HENP-DS-2表现出较强的致病性,推测可能是疫苗毒经猪群传代后毒力或致病性增强所致,但造成其毒力返强的确切原因需进一步研究。本研究对了解河南省PRRSV 流行 株 的 遗 传 进 化 特 征、致 病 性 变 化 及PRRSV 疫苗的选择和使用具有重要的参考价值。

专家介绍
常洪涛 

作者介绍:博士,河南农业大学副教授,最接地气的猪病实战专家,研究方向为动物分子病毒学及新型疫苗研发。先后获得“河南省教学标兵”、全国高校教师教学竞赛河南省一等奖、河南省科学技术进步一等奖等省、部级奖励8项,主持或参加各项课题12项,获国家发明专利3项,共计发表学术论文117篇,出版学术著作3部,常年为美国硕腾、德国勃林格和大北农集团等20余家上市企业提供技术支持,担任多个县市科技特派员和科技服务专家;开展各类科技讲座和技术研讨会800余场,被中国共青团网、河南省电视台等十多家官方媒体报道。

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